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Produit de séquençage rtPCR

Produit de séquençage rtPCR


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J'ai donc un ensemble validé d'amorces pour la rtPCR de Biorad qui contient du vert SYBR. Si je fais de la rtPCR, puis-je utiliser le produit rtPCR après l'avoir purifié avec un kit de purification Qiagen PCR ? De plus, j'ai l'impression que la société de séquençage a besoin d'amorces pour effectuer le séquençage, dois-je simplement utiliser l'amorce PCR ou l'une des amorces "universelles" de la société ?


Vous pouvez utiliser le kit de purification PCR pour nettoyer l'ADN.

Vous pouvez utiliser les amorces que vous avez utilisées pour le RTPCR pour le séquençage. Les amorces universelles ne fonctionneraient que si la séquence qui leur est complémentaire se trouve à l'extrémité 3' de votre amplicon.


Produit de séquençage RT-PCR - (14 mars 2013 )

J'ai donc un ensemble validé d'amorces pour la rtPCR de Biorad qui contient du vert SYBR. Si je fais de la rtPCR, puis-je utiliser le produit rtPCR après l'avoir purifié avec un kit de purification Qiagen PCR ? De plus, j'ai l'impression que la société de séquençage a besoin d'amorces pour effectuer le séquençage, dois-je simplement utiliser l'amorce PCR ou l'une des amorces "universelles" de la société ?

Par rtPCR, vous entendez la PCR en temps réel ou transcription inverse ? Dans le premier cas, pour éviter toute confusion, il est préférable d'utiliser la PCR quantitative (qPCR).

Pour autant que je sache, les amorces ne contiennent pas de vert sybr, l'agent sybr ressemble beaucoup au bromure d'éthidium en ce sens qu'il repose sur l'intercalation entre les brins d'ADN à une densité particulière par pb, et en tant que tel, sybr est ajouté dans le cadre du mastermix PCR. Il est cependant possible d'obtenir des amorces marquées par fluorescence (fl) telles que les amorces de test Taqman.

En pratique, peu importe que les amorces soient étiquetées pour une utilisation dans le séquençage, bien que je ne l'aie jamais essayé. Je peux imaginer qu'une amorce étiquetée Fl peut obscurcir le signal de certains des appels de base initiaux si elle est utilisée.

Pour le séquençage, oui, la société a besoin d'amorces, vous devez configurer un tube qui contient l'ADN cible et UNE amorce uniquement - si vous avez les deux amorces dans le même tube, vous obtiendrez un signal mixte car les régions directe et inverse sont séquencées simultanément (pensez à la façon dont l'ADN est répliqué et à l'orientation des deux brins).

Les amorces universelles sont uniquement destinées au séquençage de plasmides (et même alors, uniquement pour certains plasmides) si votre produit n'est pas contenu dans un plasmide, vous devez fournir l'amorce appropriée.

bob1 le ven 15 mars 04:11:59 2013 a dit :

Par rtPCR, vous entendez la PCR en temps réel ou transcription inverse ? Dans le premier cas, pour éviter toute confusion, il est préférable d'utiliser la PCR quantitative (qPCR).

Pour autant que je sache, les amorces ne contiennent pas de vert sybr, l'agent sybr ressemble beaucoup au bromure d'éthidium en ce sens qu'il repose sur l'intercalation entre les brins d'ADN à une densité particulière par pb, et en tant que tel, sybr est ajouté dans le cadre du mastermix PCR. Il est cependant possible d'obtenir des amorces marquées par fluorescence (fl) telles que les amorces de test Taqman.

En pratique, peu importe que les amorces soient étiquetées pour une utilisation dans le séquençage, bien que je ne l'aie jamais essayé. Je peux imaginer qu'une amorce étiquetée Fl peut obscurcir le signal de certains des appels de base initiaux si elle est utilisée.

Pour le séquençage, oui, la société a besoin d'amorces, vous devez configurer un tube contenant l'ADN cible et UNE amorce uniquement - si vous avez les deux amorces dans le même tube, vous obtiendrez un signal mixte car les régions directe et inverse sont séquencées simultanément (pensez à la façon dont l'ADN est répliqué et à l'orientation des deux brins).

Les amorces universelles sont uniquement destinées au séquençage de plasmides (et même alors, uniquement pour certains plasmides) si votre produit n'est pas contenu dans un plasmide, vous devez fournir l'amorce appropriée.


Merci de m'avoir éclairci. Oui, je voulais dire qPCR. Et non, les amorces ne contiennent pas de vert SYBR, qui fait partie du master mix, vous avez raison. J'ai fait quelques erreurs décrivant ce que je veux faire parce que c'est la première fois que j'ai essayé la PCR.

Vous devriez demander à la société si le dé SYBR interfère avec leurs séquenceurs. Le moyen le plus sûr de le faire serait de purifier le produit dans la colonne (j'ai utilisé ceux de Thermo Fisher - Kit de purification GenJet PCR) - id fait ce qu'il dit


Séquençage direct des produits PCR

Pour obtenir des données de séquençage de haute qualité, il est très important que la réaction PCR soit spécifique et forte. Si le produit PCR est un frottis sur un gel d'agarose, ou si plus d'une bande est présente, la probabilité d'obtenir de bonnes données de séquence est faible.

Vous devez retirer toutes les amorces PCR et les nucléotides non incorporés avant le séquençage du produit. Le séquençage utilise une seule amorce au lieu des deux utilisées en PCR. Si vous ne retirez pas les deux amorces, vous obtiendrez deux séquences superposées qui ne seront pas lisibles.

Il est acceptable d'utiliser une amorce PCR pour le séquençage tant qu'elle correspond à nos conditions. S'il te plait regarde Directives d'amorce pour plus d'informations.

Vérifiez la concentration PCR à l'aide d'un gel d'agarose analytique. Une concentration excessive de votre modèle ne vous donnera pas une meilleure séquence et pourrait potentiellement interférer avec les échantillons des chercheurs voisins sur l'instrument.

Applied Biosystems a un manuel utile pour le séquençage PCR qui peut être téléchargé sous forme de fichier PDF. Vous aurez besoin d'Acrobat Reader pour terminer le téléchargement.

Un autre livret utile est le Qiagen Guide to Template Purification and DNA Sequencing.

Les recommandations pour les brochures techniques données ci-dessus ne représentent en aucun cas une approbation des produits ABI ou Qiagen.


Jeu d'amorces universel pour l'amplification et le séquençage des sites de clivage HA0 de tous les virus de la grippe A

L'analyse des séquences du site de clivage endoprotéolytique au sein de la protéine précurseur de l'hémagglutinine (HA) HA(0) est fondamentale pour les études de biologie moléculaire des virus de la grippe A, en particulier pour le pathotypage moléculaire des isolats de sous-type H5 et H7. Un problème actuel pour les diagnostics de routine est l'émergence de nouvelles souches du sous-type H5 ou H7 ou même d'autres sous-types qui échappent à la détection par les protocoles de transcription inverse-PCR (RT-PCR) couramment utilisés. Ici, le premier test RT-PCR pan-HA (PanHA) ciblant le site de clivage HA(0) des virus de la grippe A des 16 sous-types HA est rapporté. Le test a été évalué par rapport aux RT-PCR spécifiques aux sous-types H5 et H7 pour le site de clivage HA(0) et à une RT-PCR en temps réel détectant le gène M. Un panel de 92 virus grippaux A a été utilisé pour la validation. Les données de séquence pour les virus de la grippe A à partir de 32 échantillons de liquide allantoïdien et de 11 échantillons d'écouvillonnage de diagnostic des 16 sous-types d'HA ont été générées par séquençage direct des produits PanHA RT-PCR. Les résultats démontrent que le nouveau test PanHA RT-PCR - suivi d'un séquençage cyclique - peut compléter les méthodes existantes et renforcer la fiabilité des diagnostics du virus de la grippe A, permettant à la fois le pathotypage moléculaire (H5 et H7) et le sous-typage (non-H5 ou - H7) au sein d'une même approche.


RÉSULTATS ET DISCUSSION

Par la stratégie de calcul RNomics, les étudiants ont identifié environ 80 snoRNAs avec des caractéristiques structurelles typiques de la famille box C/D snoRNA de N. crassa, C. glabrata, D. hansenii, K. lactis, et Y. lipolytica. L'analyse informatique a montré que ces snoARN existent sous forme unique ou de groupe de gènes et montrent diverses organisations génomiques dans différents champignons. La plupart des snoARN de C. glabrata et K. lactis les snoARN sont transcrits indépendamment, tandis que les snoARN de N. crassa, D. hansenii, et Y. lipolytica étaient nichés dans les introns des gènes de l'hôte.

Au laboratoire, les étudiants ont fonctionné individuellement. Chaque étudiant a sélectionné un snoRNA ou un cluster de snoRNA pour terminer son expérience. Au début, les étudiants ont isolé l'ARN total de ces champignons. En utilisant la méthode mentionnée ci-dessus, tous les étudiants ont obtenu 250 à 300 g d'ARN total à partir de 10 ml de culture de cellules fongiques. Les rapports A260/A280 des préparations d'ARN étaient de 1,85-1,98, illustrant un ARN de bonne qualité en ce qui concerne la pureté. De plus, l'électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose formaldéhyde a montré trois bandes distinctes et la bande d'ARNr 25S était significativement plus intense que la bande d'ARNr 18S, indiquant que les ARN extraits des champignons étaient entièrement intacts et que la dégradation de l'ARN ne s'était pas produite. Les résultats de deux gels étudiants sont présentés sur la figure 1.

Analyse par électrophorèse de l'ARN total de champignons. Piste 1, ARN total de N. crassa. Piste 2, ARN total de D. hansenii. Les ARNr de 25S, 16S et 5.8S sont très visibles sur le gel.

Ensuite, les étudiants ont réalisé une RT-PCR pour analyser l'expression du snoRNA. La plupart des étudiants ont obtenu des produits de RT-PCR. Pour les étudiants qui n'étaient pas en mesure d'obtenir des produits RT-PCR, les instructeurs avaient des étudiants qui ont réussi à partager leurs produits afin que tous les étudiants puissent continuer à progresser dans le projet. La figure 2 montre les résultats d'un élève. L'étudiant a analysé un groupe de gènes snoRNA situé dans une souche antisens d'un gène de protéine putatif dans N. crassa génome par RT-PCR. Étant donné que le gène contient deux introns (Fig. 2une) selon le logiciel d'analyse, les produits RT-PCR doivent contenir trois bandes. Comme prévu, les produits de RT-PCR de N. crassa l'ARN total, avec la paire d'amorces P1/P2, était composé de trois bandes, dont la plus grande (511 pb) correspondait aux séquences du produit PCR de N. crassa ADN génomique, le plus petit produit de RT-PCR (120 pb) correspondait à un transcrit épissé dépourvu de deux séquences introniques, et celui du milieu était l'intermédiaire d'épissage, dans lequel un intron a été retiré (Fig. 2b). Le clonage et le séquençage des trois produits de RT-PCR ont vérifié la présence de transcrits épissés matures et d'intermédiaires d'épissage dont les introns ont été retirés à la position exacte comme prévu (Fig. 3). Les résultats ci-dessus ont montré que l'analyse informatique des sites d'épissage est correcte et que l'ARN préparé par l'étudiant est entièrement intact avec lequel tous les produits exprimés, y compris les précurseurs, les intermédiaires d'épissage et le transcrit épissé mature d'un gène, peuvent être obtenus.

séquence flanquante de cluster de gènes snoRNA et analyses RT-PCR. (une) séquence flanquante snR55 et snR61 de N. crassa. Les régions codantes pour les snoARN sont ombrées, les exons de l'ARN non codant sont en majuscules, l'intron est en minuscules les sites d'épissage et les séquences donneur/accepteur (encadré) sont indiqués. Les flèches indiquent les emplacements des amorces utilisées pour l'analyse RT-PCR. (b) Analyse RT-PCR. Piste 1, RT-PCR, après transcription inverse de N. crassa l'ARN total avec l'amorce P1, la PCR a été réalisée avec la paire d'amorces P1/P2. Le petit produit de RT-PCR (120 pb) correspond au transcrit épissé, le précurseur non épissé du transcrit (511 pb) est également détectable. Piste 2, contrôle ADN, PCR de N. crassa l'ADN génomique avec la paire d'amorces P1/P2 prédit le produit PCR est de 511 pb. Piste 3, contrôle PCR, PCR de N. crassa ARN total avec la paire d'amorces P1/P2.

La séquence du produit RT-PCR correspond au transcrit épissé du groupe de gènes snoRNA. La position de l'intron retiré est indiquée par une pointe de flèche. (une) Détection de l'élimination du premier intron d'un intermédiaire d'épissage. (b) Détection de l'élimination des seconds introns d'un intermédiaire d'épissage.

En résumé, cette procédure de laboratoire représente une méthode efficace et cohérente pour préparer les étudiants avancés à participer à la recherche. Cette procédure initie les étudiants au concept de RNomique, d'ARN non codant et d'épissage d'ARN, à l'application de bases de données biologiques et d'outils bioinformatiques, et à la pratique des techniques moléculaires de base. Nous pensons que la procédure devrait être applicable pour étudier d'autres ARN non codants sans trop de modifications.


Séquençage direct des produits de RT-PCR du virus de l'hépatite A et du norovirus à partir d'huîtres contaminées par l'environnement à l'aide d'amorces à queue M13

Le norovirus humain (HuNoV) et l'hépatite A (HAV) sont reconnus comme les principales causes de maladies d'origine alimentaire non bactériennes aux États-Unis. Le séquençage de l'ADN est généralement considéré comme la norme pour un génotypage viral précis à l'appui des enquêtes épidémiologiques. En raison de la diversité génétique des norovirus (NoV), les ensembles d'amorces dégénérées sont souvent utilisés dans la PCR de transcription inverse (RT) conventionnelle et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) pour la détection de ces virus et les fragments d'ADNc sont généralement clonés. avant le séquençage. Les méthodes de détection du VHA qui sont sensibles et spécifiques à la RT-qPCR en temps réel donnent des fragments de petite taille de 89 à 150 pb, qui peuvent être difficiles à séquencer. Afin de surmonter ces obstacles, les amorces de norovirus et de HAV ont été suivies d'amorces directes et inverses M13. Cette modification augmente la taille du produit séquencé et permet un séquençage direct des amplicons en utilisant des amorces M13 complémentaires. Les produits d'ADNc HuNoV et HAV provenant d'huîtres contaminées par l'environnement ont été analysés à l'aide de cette méthode. Les alignements des échantillons séquencés ont révélé ≥ 95 % d'identités de nucléotides. Les amorces de queue NoV et HAV avec la séquence M13 augmentent la taille du produit d'ADNc, offrent une alternative au clonage et permettent un séquençage rapide, précis et direct des produits d'ADNc produits par des tests RT-qPCR conventionnels ou en temps réel.


Produits NEBNext ® ARTIC pour le séquençage du SARS-CoV-2

Surtout avec l'émergence continue de variantes du SRAS-CoV-2 qui affectent la transmission du virus et d'autres mesures importantes pour la santé publique, il existe un besoin croissant de méthodes fiables, précises et rapides pour le séquençage du SARS-CoV-2. Les kits NEBNext ARTIC sont basés sur les travaux originaux du réseau ARTIC, qui a rapidement adapté leurs protocoles au SARS-CoV-2 (Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt)).

La méthode ARTIC est une approche de séquençage du génome viral entier basée sur un amplicon multiplexé (Figure 1), et les options du kit NEBNext ARTIC sont compatibles avec les plates-formes de séquençage Illumina et Oxford Nanopore Technologies. Les deux kits compatibles avec le séquençage Illumina génèrent des inserts de bibliothèque de

400 pb, pour le séquençage 2 x 75 ou 2 x 250, respectivement (Figure 2). Le module RT-PCR NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 contient uniquement les réactifs nécessaires à la synthèse d'ADNc et à l'amplification ciblée d'ADNc à partir de l'ARN génomique du SARS-CoV-2.

Figure 1 : Aperçu du flux de travail NEBNext ARTIC

Pour des workflows plus détaillés, utilisez les liens ci-dessous :

Figure 2 : Options du kit NEBNext ARTIC



Les kits NEBNext ARTIC comprennent des pools d'amorces V3 ARTIC, qui ont été équilibrés à l'aide d'une méthodologie développée à NEB sur la base de données empiriques issues du séquençage. Ces amorces équilibrées offrent une plus grande uniformité de la couverture du génome (figure 3) à partir de 10 à 10 000 copies du génome du SRAS-CoV-2. Les réactifs pour la RT-PCR et la préparation de la bibliothèque sont optimisés pour le flux de travail SARS-CoV-2 ARTIC.

Figure 3 : Moins de lectures sont nécessaires pour couvrir complètement le génome avec le kit compagnon NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)

Visualisation intégrative de la visionneuse de génome de la couverture de lecture à travers le génome du SRAS-CoV-2. Les amplicons ont été générés à partir de 1 000 copies d'entrées d'ARNg viral du SRAS-CoV-2 (ATCC VR-1986 et VR-1991) dans 100 ng d'ARN de référence humain universel (ThermoFisher QS0639) à l'aide du panneau IDT ARTIC nCoV-2019 V3 (&ldquoStandard&rdquo) ou du NEBNext a équilibré les pools d'amorces ARTIC SARS-CoV-2. Les bibliothèques ont été construites à l'aide du kit d'accompagnement NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) et des kits d'extension de codage à barres natifs d'Oxford Nanopore Technologies 1-12 (EXP-NBD104) et 13-24 (EXP-NBD114), kit de séquençage de ligature ( SQK-LSK109) et le kit d'extension SFB (EXP-SFB001). Le séquençage a été effectué sur un instrument GridION utilisant des cellules d'écoulement R9.4.1. Minimap2 a été utilisé avec 24500 lectures ou 250x de données pour la cartographie contre le SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1.

Figure 4 : Couverture du génome dans une large gamme de quantités d'entrée, avec le kit de préparation de bibliothèque NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina)

Des amplicons ont été générés à partir de 1 000 copies d'entrées d'ARNg viral SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 et VR-1991) dans 100 ng d'ARN de référence humain universel (ThermoFisher QS0639) à l'aide de pools d'amorces ARTIC SARS-CoV-2 équilibrés NEBNext, avec ou sans paires d'amorces de contrôle humain NEBNext ARTIC. Les bibliothèques ont été construites à l'aide du kit de préparation de bibliothèque NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina) et séquencées sur un instrument MiSeq (2x75 pb). La fraction du génome couverte à chaque profondeur a été déterminée pour une gamme d'entrées et les lectures ont été sous-échantillonnées à 10 000, 100 000, 500 000 et 1 000 000.

Les conditions de réaction RT sont les mêmes pour toutes les quantités d'entrée, et pour les applications Illumina, une nouvelle formulation d'ADN polymérase pour l'enrichissement des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération élimine le besoin de normaliser les concentrations d'amplicons avant la préparation de la bibliothèque.

  • Amélioration de l'uniformité de la profondeur de couverture du génome du SRAS-CoV-2
  • Protocoles rationalisés et hautement efficaces
  • Efficace avec une large gamme d'entrées de génome viral (10 à 10 000 copies)
  • Disponible pour les plateformes de séquençage Illumina et Oxford Nanopore Technologies
  • Conditions RT uniques pour tous les montants d'entrée
  • Aucune exigence de normalisation de l'amplicon avant la préparation de la bibliothèque (kits compatibles Illumina)
  • Amorces humaines de contrôle d'utilisation facultatives fournies
  • Comprend des billes de purification d'échantillon NEBNext (SPRIselect ® )
  • Adaptateurs de bibliothèque et amorces disponibles séparément

Lisez ce que disent les leaders du séquençage ARTIC SARS-CoV-2

Le kit compagnon NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) fournira aux chercheurs le moyen le plus pratique d'effectuer le séquençage nanopore du SARS-CoV-2. Lors du développement du protocole ARTIC, nous nous sommes concentrés sur la récupération de génomes presque complets à partir d'échantillons cliniques difficiles avec <Ct33. Nous avons adopté une approche d'amplicon de tuilage de 400 pb car elle offre des performances robustes sur une large gamme d'entrées, y compris des échantillons d'ARN dégradé et Ct élevé qui sont souvent rencontrés. Le flux de travail de codage à barres natif fournit des amplicons pleine longueur compatibles avec le démultiplexage des meilleures pratiques et l'établissement d'un consensus basé sur les références, tandis que la préparation de la bibliothèque sans PCR minimise le risque de contamination des amplicons. Nous avons travaillé en collaboration avec NEB pour optimiser le protocole afin de minimiser les volumes de réactifs tout en améliorant les performances et cela bénéficie désormais également de pools d'amorces optimisés qui améliorent considérablement l'exhaustivité du génome et réduisent les exigences de couverture de lecture. La compatibilité avec le kit d'extension de code-barres natif à 96 codes-barres permet la flexibilité d'exécuter entre 24 et 96 échantillons en fonction de vos besoins.

- Joshua Quick, Ph.D., de l'Université de Birmingham et du réseau ARTIC

Nous avons été impressionnés par les excellentes performances du kit NEBNext ARTIC FS dans notre séquençage d'échantillons humains contenant de l'ARN du SARS-CoV-2. Avec ce kit, nous avons traité avec succès des échantillons de qualité et de quantité variables et avons été surpris par sa sensibilité et l'uniformité remarquable de la couverture du génome viral. Le délai d'exécution rapide du flux de travail robuste a été vraiment bénéfique pour nous.

- Vladimir Benes, responsable de la plateforme de génomique au Laboratoire européen de biologie moléculaire

Le kit de préparation de bibliothèque NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS assure une détermination rapide, précise et fiable du génome entier du SARS-CoV-2. En raison de sa facilité d'utilisation, le kit de préparation de bibliothèque NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS permet une intégration rapide dans le flux de travail NGS de routine. De plus, le kit fonctionne toujours de manière robuste avec des échantillons cliniques difficiles (ct>30). Je recommanderais le kit de préparation de bibliothèque NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS à 100%.


Les matrices d'ADN double brin se dénaturent à une température déterminée en partie par leur teneur en G+C. Plus la proportion de G+C est élevée, plus la température requise pour séparer les brins d'ADN matrice est élevée. Plus les molécules d'ADN sont longues, plus le temps nécessaire à la température de dénaturation choisie pour séparer complètement les deux brins est important. Si la température de dénaturation est trop basse ou si le temps est trop court dans les régions riches en AT de la matrice, l'ADN sera dénaturé. Lorsque la température est réduite plus tard dans le cycle PCR, l'ADN matrice se rehybridera dans un état entièrement natif. Dans les PCR catalysées par la Taq polymérase, la dénaturation est effectuée à 94-95 o C, qui est la température la plus élevée que l'enzyme peut supporter pendant 30 cycles ou plus sans subir de dommages excessifs. Dans le premier cycle de PCR, la dénaturation est parfois effectuée pendant 5 minutes pour augmenter la probabilité que de longues molécules d'ADN matrice soient complètement dénaturées. Cependant, cette période prolongée de température de dénaturation n'est pas nécessaire pour les molécules d'ADN linéaires car elle peut parfois être délétère. La dénaturation pendant 45 secondes à 94-95oC est couramment utilisée pour amplifier les molécules d'ADN linéaires dont la teneur en GC est <55% et une température plus élevée pour les ADN matrices et/ou cibles dont la teneur en GC est >55%. Des polymérases beaucoup plus tolérantes à la chaleur sont préférées dans de tels cas.

La température utilisée pour l'étape de recuit est critique. Si la température d'hybridation est trop élevée, les amorces oligonucléotidiques s'hybrident mal, voire pas du tout, à la matrice et le rendement en ADN amplifié est très faible. Si la température d'annelage est trop basse, un annelage non spécifique des amorces peut se produire, entraînant l'amplification de segments indésirables d'ADN. L'annelage est généralement effectué 3 à 5 °C en dessous de la température de fusion calculée à laquelle les amorces oligonucléotidiques se dissocient de leurs matrices. De nombreuses formules existent pour déterminer la Tm théorique, mais aucune d'entre elles n'est précise pour les amorces oligonucléotidiques pour toutes les longueurs et séquences. Il est préférable d'optimiser les conditions d'annelage en effectuant une série de PCR d'essai à des températures allant de 2C à 10 C en dessous de la plus basse des températures de fusion calculées pour les deux amorces oligonucléotidiques. Alternativement, le thermocycleur peut être programmé pour utiliser des températures de recuit progressivement plus basses dans des paires de cycles consécutifs (PCR "touchdown". températures de recuit dans les cycles successifs de la réaction.

Extension des amorces oligonucléotidiques est effectuée à ou près de la température optimale pour la synthèse d'ADN catalysée par la polymérase thermostable, qui dans le cas de la polymérase Taq est de 72-78 o C. Dans les deux premiers cycles, l'extension d'une amorce se poursuit au-delà de la séquence complémentaire de la liaison site de l'autre amorce. Au cycle suivant, les premières molécules sont produites dont la longueur est égale au segment d'ADN délimité par les sites de liaison des amorces. A partir du troisième cycle, ce segment d'ADN est amplifié géométriquement, tandis que les produits d'amplification plus longs s'accumulent arithmétiquement. La vitesse de polymérisation de la Taq polymérase est

2000 nucléotides/minute à la température optimale (72-78 o C) et en règle générale, l'extension est effectuée pendant 1 minute pour chaque 1000 pb de produit. Pour le dernier cycle de PCR, de nombreux chercheurs utilisent un temps d'extension 3 fois plus long que les cycles précédents, apparemment pour permettre l'achèvement de tous les produits amplifiés.


Introduction

Présentation des stratégies de séquençage à haut débit

La stratégie basée sur le fusil de chasse - la technique de préférence pour le séquençage de grands génomes d'ADN - a été utilisée pour la caractérisation complète du génome d'une gamme d'eucaryotes et de procaryotes 1,2,3,4,5,6. L'ADN génomique est cisaillé en fragments de 2 à 50 kpb. Les extrémités 2, 3' et 5' sont réparées et clonées dans un vecteur bactérien pour produire une banque. Les régions terminales de 700 pb de ces clones sont séquencées avec des amorces vectorielles indépendantes de l'insert 7, et la séquence complète est reconstruite à partir de fragments chevauchants. Les projets de séquençage à grande échelle ont stimulé les récentes améliorations techniques pour réduire le coût et le temps requis pour obtenir une résolution à séquence unique. Ces avancées consistent principalement en des alternatives à la création de bibliothèques bactériennes et à la biochimie de séquençage de Sanger 8 . Par conséquent, des procédures de séquençage intégrées qui incluent la production de bibliothèques, l'amplification d'ADN, le séquençage et l'assemblage de contigs ont récemment été développées 9,10. Ces technologies reposent toujours sur le cisaillement aléatoire de l'ADN, mais permettent la séparation de molécules modèles individuelles sur des billes et leur amplification indépendante dans un système acellulaire par PCR 11 en émulsion. Un séquençage est ensuite réalisé sur chaque bille, en utilisant le pyroséquençage 12 ou le séquençage par ligature 10 plutôt que la méthode traditionnelle de Sanger.

Cependant, l'utilisation de tels pipelines de séquençage intégrés semble inappropriée lorsqu'elle est appliquée à la génomique des virus à ARN. Premièrement, les virus sont de petits parasites intracellulaires pour lesquels de grandes quantités du matériel génétique ciblé doivent être séparées des acides nucléiques de l'hôte pour construire la banque. Cela nécessite des étapes préliminaires de culture tissulaire et d'ultracentrifugation avant le cisaillement et le clonage 13 . De plus, les rendements requis en acides nucléiques sont difficiles à obtenir lorsqu'on travaille sur des virus à ARN et/ou des virus à faible réplication. Une telle stratégie est chronophage, difficile dans le cas d'échantillons cliniques et dangereuse pour les agents pathogènes humains. Deuxièmement, les génomes d'ARN viral sont généralement petits et/ou segmentés (molécules de 1 à 10 kpb). Troisièmement, les génomes des virus à ARN sont souvent constitués de courts motifs conservés entrecoupés de longues régions présentant des niveaux élevés d'hétérogénéité génétique. Ainsi, une stratégie de séquençage courante consiste à amplifier et à séquencer des produits de PCR longs obtenus à l'aide d'amorces ciblant les régions les plus conservées. Pour ces raisons, la génomique standard de l'ARN viral s'est appuyée sur des amplifications RT-PCR de 1 à 5 kpb suivies d'une marche d'amorce, ce qui implique de novo synthèse d'amorces spécifiques pour étendre le séquençage à des régions indéterminées. La caractérisation d'une séquence de 4 kpb par cette méthode nécessite au moins six cycles de séquençage. La conception et la synthèse de nouvelles amorces rendent cette stratégie coûteuse et longue.

Les procédures alternatives peuvent être divisées en trois groupes. La première consiste à remplacer la biochimie du séquençage de Sanger par des technologies moins chères et plus rapides, comme le pyroséquençage ou le séquençage par ligation-hybridation. Cependant, leur courte longueur de lecture, limitée à 100 pb, est mal adaptée au séquençage à haut débit de génomes courts. La deuxième alternative évite de novo synthèse d'amorces en utilisant une bibliothèque d'oligonucléotides préfabriquée. Les amorces peuvent être : (i) des oligonucléotides 5-10mères synthétisés de manière aléatoire qui sont utilisés soit seuls 14,15,16 soit en combinaison modulaire 17,18,19,20,21,22 ou (ii) des oligonucléotides résultant d'une synthèse à haut débit 23,24. A ce jour, la taille des bibliothèques d'oligonucléotides nécessaires limite l'utilisation de ces méthodes. La méthode indexer walking 25 a été récemment proposée : l'ADN est soumis à des cycles de digestions suivis d'une ligature terminale d'adaptateurs oligonucléotidiques (« index »). Une extrémité de l'ADN cloné est séquencée avec l'amorce universelle M13, et cette première séquence est analysée pour trouver des sites de restriction d'endonucléase spécifiques proches de son extrémité 3'. L'ADN est digéré avec l'enzyme sélectionnée avant la ligature d'un indexeur double brin spécifique, amplifié par PCR et soumis à un séquençage Sanger amorcé avec l'indexeur. Ces étapes sont répétées et permettent une progression unidirectionnelle dans la séquence inconnue. Comme la bibliothèque de l'indexeur est considérablement plus petite que celles proposées précédemment, la marche de l'indexeur pourrait être une méthode rentable car elle évite la synthèse systématique d'amorces. Cependant, la procédure reste chronophage pour les raisons suivantes : (i) le choix de l'indexeur est fonction de la séquence nucléotidique déterminée au cycle précédent et (ii) la manipulation expérimentale pour un seul cycle de digestion-ligation implique une amplification de l'ADN et Purification de l'ADN par purification sur gel, précipitation à l'éthanol et billes revêtues de streptavidine.

Présentation de la technique LoPPS

La troisième alternative utilise la stratégie du fusil de chasse pour créer, à partir d'un produit PCR, une bibliothèque d'ADN de fragments suffisamment courts pour permettre un séquençage complet en une seule étape. L'un des principaux avantages de la stratégie shotgun est le potentiel d'automatisation de l'ensemble du processus. L'automatisation de la croissance bactérienne, la purification et le séquençage de l'ADN plasmidique permettent le séquençage rapide de nombreux grands génomes d'ADN selon des normes de haute qualité avec des profils de coûts attractifs. Nous avons développé la procédure de séquençage long des produits PCR (LoPPS) (voir Fig. 1) sur la base de cette stratégie shotgun. Des produits PCR de trois à cinq kilobases, générés par n'importe quelle méthode PCR ou RT-PCR standard, sont cisaillés au hasard par ultrasons en fragments d'ADN de 700 pb. Les extrémités saillantes sont réparées pour créer des extrémités franches et des surplombs A 3' ajoutés pour permettre le clonage TA et pour éviter la concaténation de fragments. Le nombre de clones requis pour la reconstruction du contig est prédit à partir de la longueur du produit PCR initial (voir tableau 1 et réf. 36). Les clones sont sélectionnés au hasard et séquencés avec l'amorce du vecteur T7 PROM. Enfin, la séquence cible est reconstruite à partir de fragments chevauchants.


Renseignements à l'appui

S1 Fig. Prétraitement des données SCAN-seq et contrôle qualité.

(A) Schéma des prétraitements de données SCAN-seq (pour plus de détails, voir Méthodes). (B) La distribution de longueur des produits d'ADNc avant la construction de la bibliothèque. (C, D) Distribution de longueur des lectures complètes. Les données numériques sont répertoriées dans S2 Data. SCAN-seq, amplification monocellulaire et séquençage d'ARN pleine longueur par la plateforme Nanopore.

S2 Fig. Qualité des données des mESC à l'aide de SCAN-seq.

(A) Courbe de saturation des gènes et des isoformes détectés dans le mESC. (B) Heatmap de la valeur de corrélation (Pearson) entre chaque paire de mESC. La valeur de corrélation des mESC par SCAN-seq était encore meilleure que celle par SUPeR-seq et la méthode Tang 2009. (C) Couverture des lectures tout au long des transcriptions. (A–C) Les données numériques sont répertoriées dans S2 Data. mESC, SCAN-seq de cellules souches embryonnaires de souris, amplification monocellulaire et séquençage d'ARN pleine longueur par la plateforme Nanopore SUPeR-seq, séquençage d'ARN poly(A) universel unicellulaire indépendant.

S3 Fig. Courbe de saturation des gènes et isoformes détectés dans les cellules à différents stades de développement.

Les données numériques sont répertoriées dans S2 Data.

S4 Fig. Analyse de l'expression génique dans des échantillons embryonnaires de souris.

(A) Nombre de gènes détectés dans chaque cellule individuelle à chaque stade/type de développement. Les données numériques sont répertoriées dans S2 Data. (B) Correspondance des gènes spécifiques au stade détectés à l'aide de SCAN-seq et SUPeR-seq. (C) Analyse GO du groupe 6 de gènes dans la figure 3D. GO, ontologie génique SCAN-seq, amplification monocellulaire et séquençage d'ARN pleine longueur par la plateforme Nanopore SUPeR-seq, séquençage d'ARN poly(A)-indépendant universel monocellulaire.

S5 Fig. LncRNAs détectés dans des embryons préimplantatoires de souris.

(A) Le ratio de lecture des mESC et de tous les blastomères à différents stades de développement. Le centre représente la moyenne et les barres d'erreur représentent le SEM. (B) Heatmap montrant les niveaux d'expression des LncRNAs dans toutes les cellules. (A, B) Les données numériques sont répertoriées dans S2 Data. lncRNA, ARN long non codant mESC, SEM de cellules souches embryonnaires de souris, erreur standard de la moyenne.


Voir la vidéo: Vidéo: Séparation des produits de PCR par électrophorèse sur gel (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Darel

    Excusez-moi, le message est enlevé

  2. Maran

    Quels mots ... super, pensée brillante

  3. Heortwiella

    Quels mots ... super, une phrase merveilleuse

  4. Juan

    C'est dommage que maintenant je ne peux pas exprimer - je me dépêche de travailler. Mais je serai libéré - j'écrirai nécessairement que je pense.

  5. Gradon

    haaaaaa ........ la classe

  6. Parsa

    Elle a visité l'idée tout simplement brillante



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