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3.3F : Microscopie électronique - Biologie

3.3F : Microscopie électronique - Biologie



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Objectifs d'apprentissage

  • Décrire la technique utilisée pour la microscopie électronique, en distinguant les différents types

La microscopie électronique utilise un faisceau d'électrons comme source d'énergie. Un faisceau d'électrons a une longueur d'onde exceptionnellement courte et peut toucher la plupart des objets sur son chemin, augmentant la résolution de l'image finale capturée. Le faisceau d'électrons est conçu pour voyager dans le vide afin de limiter les interférences des molécules d'air. Des aimants sont utilisés pour focaliser les électrons sur l'objet vu.

Il existe deux types de microscopes électroniques. La forme la plus traditionnelle est le microscope électronique à transmission (MET). Pour utiliser cet instrument, des tranches ultra-fines de micro-organismes ou de virus sont placées sur une grille métallique puis colorées à l'or ou au palladium avant visualisation, pour créer un contraste. Les parties densément revêtues de l'échantillon dévient le faisceau d'électrons et des zones sombres et claires apparaissent sur l'image. Le TEM peut projeter des images dans une résolution beaucoup plus élevée, jusqu'au niveau atomique d'objets plus minces.

La deuxième forme et la plus contemporaine est le microscope électronique à balayage (MEB). Il permet la visualisation des micro-organismes en trois dimensions car les électrons sont réfléchis lorsqu'ils sont passés sur l'échantillon. La même coloration à l'or ou au palladium est utilisée.

La microscopie électronique a de multiples applications. Il est idéal pour :

  • explorer les mécanismes moléculaires in vivo de la maladie;
  • visualiser l'architecture tridimensionnelle des tissus et des cellules;
  • déterminer la conformation des structures et des complexes protéiques flexibles;
  • observer des virus individuels et des complexes macromoléculaires dans leur contexte biologique naturel.

La préparation des échantillons peut être critique pour générer une image réussie car le choix des réactifs et des méthodes utilisés pour traiter un échantillon dépend largement de la nature de l'échantillon et de l'analyse requise.

Points clés

  • Un faisceau d'électrons, au lieu de lumière, est utilisé avec un microscope électronique.
  • Les microscopes électroniques ont un grossissement plus important car les longueurs d'onde des électrons sont beaucoup plus petites que celles de la lumière visible (0,005 nm contre 500 nm respectivement - cent mille fois plus petites).
  • Il existe deux types de microscopes électroniques, à balayage et à transmission.
  • Les meilleurs microscopes optiques composés peuvent grossir 2000x, les microscopes électroniques peuvent grossir jusqu'à 100000x.

Mots clés

  • un faisceau d'électrons: un flux d'électrons observé dans des tubes à vide.

La science des matériaux

Le domaine interdisciplinaire de la science des matériaux, aussi communément appelé science et génie des matériaux, couvre la conception et la découverte de nouveaux matériaux, en particulier les solides. Les origines intellectuelles de la science des matériaux remontent au siècle des Lumières, lorsque les chercheurs ont commencé à utiliser la pensée analytique de la chimie, de la physique et de l'ingénierie pour comprendre les observations phénoménologiques anciennes en métallurgie et en minéralogie. [1] [2] La science des matériaux incorpore toujours des éléments de physique, de chimie et d'ingénierie. En tant que tel, le domaine a longtemps été considéré par les institutions académiques comme un sous-domaine de ces domaines connexes. À partir des années 1940, la science des matériaux a commencé à être plus largement reconnue comme un domaine spécifique et distinct de la science et de l'ingénierie, et les grandes universités techniques du monde entier ont créé des écoles dédiées à son étude.

Les scientifiques des matériaux mettent l'accent sur la compréhension, comment l'histoire d'un matériau (En traitement) influence sa structure, et donc les propriétés et les performances du matériau. La compréhension des relations traitement-structure-propriétés est appelée le paradigme des matériaux. Ce paradigme est utilisé pour faire progresser la compréhension dans divers domaines de recherche, notamment la nanotechnologie, les biomatériaux et la métallurgie.

La science des matériaux est également une partie importante de l'ingénierie médico-légale et de l'analyse des défaillances - enquête sur les matériaux, les produits, les structures ou les composants, qui échouent ou ne fonctionnent pas comme prévu, causant des blessures ou des dommages matériels. De telles enquêtes sont essentielles pour comprendre, par exemple, les causes de divers accidents et incidents d'aviation.


Microscope optique et électronique corrélatif intégré SECOM

La plate-forme SECOM est une solution intégrée unique pour la microscopie optique et électronique corrélative qui vous permet d'effectuer une microscopie corrélative extrêmement rapidement avec la plus haute qualité optique et la plus haute précision de superposition. La combinaison du pouvoir de marquage de l'imagerie par fluorescence et des informations structurelles à haute résolution de la microscopie électronique fait de la microscopie corrélative l'outil idéal pour étudier la relation complexe entre forme et fonction en biologie.

Le SECOM est le seul produit à ce jour qui intègre la fluorescence et la microscopie électronique à balayage dans un seul appareil en équipant un microscope électronique à balayage (MEB) d'un microscope à fluorescence inversé. La plate-forme peut être montée sur un SEM en remplaçant la porte de la chambre du SEM. Ce remplacement prend en charge une platine motorisée et l'objectif et le trajet de la lumière pour le microscope optique.

Grâce à sa conception intégrée, le passage de la fluorescence à l'imagerie électronique est fluide et instantané. Et avec la procédure d'alignement automatisée, vous visualisez directement le bon emplacement à haute résolution. La plate-forme SECOM est livrée avec un progiciel intuitif conçu pour acquérir facilement les deux types d'informations. Le progiciel peut également contrôler la platine SECOM et les réglages du microscope électronique.

La plate-forme SECOM peut facilement être intégrée dans le flux de travail existant et agit comme un microscope optique haut de gamme entièrement équipé, sans compromis sur les performances optiques ou électroniques.


Résultats

Conception et mise en œuvre de FerriTagging

FerriTagging implique la création d'une particule de ferritine (FerriTag) qui peut être liée de manière inductible à une protéine d'intérêt en utilisant le système d'hétérodimérisation FKBP-rapamycine-FRB (Fig. 1a). Pour ce faire, FerriTag est co-exprimé avec la protéine d'intérêt qui est fusionnée à FKBP-GFP. FerriTag est FTL non marqué et FRB-mCherry-FTH1 transfecté dans un rapport de 4:1. Lorsque la rapamycine est ajoutée, elle induit l'hétérodimérisation des domaines FKBP et FRB, ce qui fait que la protéine cible devient FerriTagged (Fig. 1a).

Conception et mise en œuvre de FerriTagging. une Schéma de principe de la chaîne légère de la clathrine FerriTagging. Expression simultanée de FerriTag et de la chaîne légère de clathrine marquée par GFP-FKBP. L'ajout de rapamycine induit l'hétérodimérisation des domaines FKBP et FRB résultant en FerriTagging de la clathrine dans une vésicule recouverte de clathrine. b Images fixes de l'imagerie de cellules vivantes de la chaîne légère de la clathrine FerriTagging. De la rapamycine (200 nM) a été ajoutée au point de temps zéro, comme indiqué par la barre orange. Un marquage spécifique et rapide de la clathrine par FerriTag peut être observé immédiatement. Temps, min : sec, barre d'échelle, 10 m. Les zooms montrent une expansion ×4. Voir Film supplémentaire 1. c Fluorescence FerriTag (mCherry) dans les spots GFP-FKBP-LCa-positifs en fonction du temps. La trace et l'ombrage rouges indiquent la moyenne ± s.e.m. pour 5 cellules. La rapamycine a été appliquée comme indiqué par la barre orange. Images typiques de l'absorption de transferrine (Tf-647, bleu) dans les cellules HeLa exprimant FerriTag (rouge) et GFP-FKBP-LCa (vert). La rapamycine (200 nM) ou le contrôle est appliqué comme indiqué par des barres orange foncé et clair, respectivement. Le contrôle négatif du saccharose hypertonique pour bloquer la CME est montré (violet). Barre d'échelle, 10 m. e Nuage de points de l'absorption de transferrine. Les points représentent les mesures de cellules individuelles, à partir de deux expériences indépendantes, les barres indiquent la moyenne ± SD

Notre première tentative d'utiliser la ferritine comme marqueur impliquait la fusion directe de FTH1 à une protéine d'intérêt, similaire à un système bactérien décrit précédemment 9 . Des cellules de mammifères exprimant mCherry-FTH1 fusionnées à la séquence de ciblage mitochondrial de Tom70p ont été cultivées dans des conditions riches en fer, puis visualisées par microscopie à fluorescence (voir la note supplémentaire 1). Il était clair que cette fusion directe entraînait une agrégation et une mauvaise localisation des mitochondries, très probablement en raison de la nature multivalente de la molécule de ferritine. Cette observation nous a conduits à concevoir une nouvelle étiquette de ferritine qui pourrait former une particule de ferritine indépendamment, puis être ajoutée de manière inductible à une protéine d'intérêt pour éviter de tels problèmes d'agrégation. La dilution des sous-unités FTH1 étiquetées FRB-mCherry avec des sous-unités FTL non étiquetées est également une étape importante car l'agrégation a été observée lorsque FRB-mCherry-FTH1 était exprimé seul. Le résultat de cette version diluée-étiquetée de la ferritine, n'était aucune agrégation ni erreur de localisation avant ou après l'ajout de rapamycine (voir Fig. 1 supplémentaire).

Notre première protéine cible pour FerriTagging était la clathrine. Les cellules HeLa exprimant FerriTag et la chaîne légère de clathrine a (LCa) marquées avec GFP et FKBP ont été imagées par microscopie à fluorescence (Fig. 1b). Ces expériences montrent qu'après l'ajout de rapamycine (200 nM), le FerriTagging des structures recouvertes de clathrine se produit en quelques secondes (Fig. 1c). Le signal diffus FerriTag peut être vu pour décorer spécifiquement les structures recouvertes de clathrine dans toute la cellule, avec un étiquetage complet après 30 s (Fig. 1b et film supplémentaire 1). Nous avons également testé si le FerriTagging de la clathrine inhibait sa fonction endocytaire. Pour ce faire, nous avons mesuré l'absorption de transferrine dans des cellules où la clathrine avait été FerriTagged et les avons comparées à des cellules témoins sans traitement à la rapamycine (Fig. 1d, e). Nous n'avons trouvé aucune différence dans l'absorption de la transferrine, ce qui suggère que le FerriTagging sur une courte échelle de temps (12 min) n'interfère pas grossièrement avec la fonction de la clathrine. L'inhibition de la CME a pu être facilement détectée par un prétraitement des cellules avec du saccharose hypertonique (0,45 M). Cette approche fonctionnant, nous avons ensuite voulu observer FerriTagging par EM.

Visualisation des protéines FerriTagged par microscopie électronique

Afin d'évaluer si FerriTagging fonctionne ou non au niveau EM, nous avons utilisé la microscopie électronique corrélative (CLEM). Notre protocole EM a été optimisé afin que nous puissions facilement distinguer FerriTag de l'arrière-plan et toujours être en mesure de voir l'ultrastructure cellulaire (Fig. 2a). Nous avons initialement FerriTagged deux protéines différentes à des emplacements disparates : 1) la monoamine oxydase (MAO), une protéine de la membrane mitochondriale externe, et 2) la chaîne légère a (LCa) de la clathrine, qui fait partie du triskel de la clathrine (Fig. 2b). Après l'ajout de rapamycine, FerriTag a été confirmé par microscopie à fluorescence pour marquer spécifiquement chaque protéine d'intérêt rapidement. Après fixation et traitement, des sections de résine ultrafines prélevées dans la même cellule ont été imagées par EM. Dans chaque cas, des particules denses aux électrons d'environ 7 nm de diamètre pouvaient être facilement distinguées du bruit de fond, et l'ultrastructure de la cellule était visible. Nous avons pu localiser des particules spécifiquement à proximité des mitochondries (dans le cas de la MAO) ou des fosses et vésicules recouvertes de clathrine (dans le cas de la LCa) où chaque protéine d'intérêt est localisée (Fig. 2b).

Visualisation des protéines FerriTagged par microscopie optique et électronique. une Aperçu des étapes de préparation des échantillons pour corréler la microscopie optique (LM) avec la microscopie électronique (EM) à l'aide de FerriTag. b Micrographies optiques et électroniques de cellules HeLa co-exprimant FerriTag avec FKBP-GFP-Myc-MAO (MAO) ou GFP-FKBP-LCa (LCa). Les images de localisation (à gauche) garantissent que la même cellule peut être suivie tout au long du flux de travail. Imagerie de cellules vivantes de FerriTagging (au milieu), les cellules ont été traitées avec de la rapamycine (200 nM) comme indiqué par la barre orange pleine. La dernière image est affichée avant que la cellule ne soit fixée et traitée pour CLEM comme décrit dans une. Les images MET (à droite) de sections prises à partir de la même cellule montrent des particules FerriTag marquant spécifiquement la protéine d'intérêt marquée GFP-FKBP dans chaque expérience CLEM. Deux particules par micrographie sont représentées agrandies vers la droite. Barre d'échelle de microscopie optique 10 m et zoom ×12. Barre d'échelle de micrographie électronique 50 nm et zoom ×7.25. c Micrographies électroniques de cellules exprimant FerriTag et GFP-FKBP-LCa, contrôle (orange clair) ou traitées à la rapamycine (orange foncé). L'emplacement des particules visibles, aucune dans le contrôle, quatre dans la rapamycine traitée sont indiqués (cercles jaunes). L'incidence des particules dans les régions cytoplasmiques (bleu) ou les régions membraneuses proximales revêtues (rose) a été enregistrée. Les régions proximales de la membrane sont définies comme une zone de 50 nm sur le côté cytoplasmique de la membrane. Cette région est encore subdivisée en zones enduites et en zones où aucun pelage évident n'est visible. Les exemples de micrographies n'ont pas de régions membraneuses proximales non revêtues. Barre d'échelle, 100 nm. À droite, nuage de points montrant la densité des particules dans les volumes cytoplasmiques (cyto, bleu), membranaires (mem, gris) ou revêtus (manteau, rose), en comparant le témoin (Nexp = 3) et des cellules traitées à la rapamycine (Nexp = 4). Les volumes sont calculés en multipliant la surface par l'épaisseur de la section (voir Analyse d'image dans Méthodes)

Étant donné que le protocole FerriTagging CLEM implique la pré-incubation des cellules dans un milieu supplémenté en fer et un traitement ultérieur avec de la rapamycine, nous avons exploré si ces étapes perturbaient la biologie cellulaire normale (note supplémentaire 2). En bref, nous avons trouvé des conditions pour la préincubation du fer dans les cellules HeLa qui étaient non toxiques et n'affectaient pas l'ultrastructure (Fig. 2 supplémentaire). La charge en fer et le traitement à la rapamycine n'ont pas affecté la localisation d'une gamme de marqueurs cellulaires représentant le cytosquelette d'actine, les lysosomes, les mitochondries, les cavéoles, le réticulum endoplasmique, les structures recouvertes de clathrine, les microtubules, les filaments intermédiaires, les noyaux et les complexes d'adhérence (Fig. 3 supplémentaire ). L'incubation des cellules avec la rapamycine pour FerriTagging est généralement brève et insuffisante pour induire l'autophagie (Fig. 4a supplémentaire). Un mutant T2098L de FerriTag peut être utilisé avec le Rapalog AP21967 si un FerriTagging prolongé est requis et/ou si l'autophagie est un problème (Fig. 4b supplémentaire).

Dans les expériences de Ferritagging, les particules observées par EM correspondent très probablement à FerriTag pour quatre raisons. Premièrement, la taille et la forme des particules étaient compatibles avec la ferritine et un marquage a été observé aux endroits attendus (Fig. 3a). Deuxièmement, aucun marquage n'a été observé au niveau des fosses recouvertes de clathrine (CCP) dans les cellules lorsque la MAO était FerriTagged, et les mitochondries n'étaient pas marquées dans les cellules lorsque la clathrine était FerriTagged (Fig. 3b). Troisièmement, aucune particule n'a été observée à côté de l'organite approprié dans les cellules où aucune rapamycine n'avait été ajoutée (Fig. 3c). Quatrièmement, les particules étaient moins denses ou étaient absentes lorsque le FerriTagging était effectué dans des cellules sans charge en fer (Fig. 3d). De ces expériences, nous concluons que FerriTag fonctionne pour marquer spécifiquement les protéines d'intérêt au niveau ultrastructural.

Identité des particules FerriTag et spécificité du FerriTagging. Micrographies électroniques d'expériences où FKBP-GFP-MAO ou GFP-FKBP-LCa ont été FerriTagged. L'ajout de rapamycine ou la pré-incubation du fer ont été effectués ou non comme indiqué. Les micrographies électroniques montrent une témoins positifs : étiquetage des mitochondries dans les cellules où la MAO a été FerriTagged (à gauche) et étiquetage des CCS dans les cellules où la clathrine a été FerriTagged (à droite), b contrôles internes : aucun étiquetage des SCC dans les cellules où la MAO a été FerriTagged (à gauche) et aucun étiquetage des mitochondries dans les cellules où la clathrine a été FerriTagged, c témoins négatifs : pas de marquage aux emplacements attendus en l'absence de rapamycine, et les particules étaient moins denses ou semblaient absentes aux endroits attendus lorsque la rapamycine était ajoutée mais qu'aucun préchargement de fer n'était effectué. Barres d'échelle, 100 nm

Efficacité du FerriTagging par microscopie électronique

Quelles sont les concentrations de fond de FerriTag et quelles densités sont observées sur l'organite cible après FerriTagging ? Pour répondre à ces questions, les particules FerriTag dans les images MET de cellules exprimant GFP-FKBP-LCa et FerriTag ont été comptées par un expérimentateur aveugle aux conditions (contrôle vs traité à la rapamycine, voir Analyse d'image dans les méthodes). L'emplacement de ces particules dans les régions cytoplasmiques ou membraneuses proximales a été enregistré et les densités de particules dans chaque région ont été calculées. Les zones enduites de la région membrane-proximale ont pu être distinguées et les densités dans ces zones ont également été déterminées.

Dans la condition de contrôle, la densité cytoplasmique vs membrane proximale enduite des particules était de 34,6 vs 0 particules par m3 (Fig. 2c). Dans les échantillons FerriTagged, les densités étaient de 72,5 contre 1308,6 particules par m 3 , un enrichissement de 18 fois (Fig. 2c). La densité des particules dans les zones membraneuses proximales revêtues dans les échantillons FerriTagged était significativement plus élevée que toutes les autres densités mesurées (p < 0,0022), qui étaient tous similaires les uns aux autres (p > 0,29, ANOVA à un facteur avec le test post-hoc de Tukey).

Nous avons utilisé une méthode stéréologique pour tester si l'intensité relative de marquage (RLI) était différente du taux attendu de points réguliers superposés sur chaque image 13 . Ces points ont été testés pour leur coïncidence avec le cytoplasme ou la région membrane-proximale enduite. Les comptes récapitulatifs et les statistiques de sept expériences CLEM individuelles sont présentés dans le tableau 1. Le RLI dans la région proximale de la membrane revêtue pour les cellules traitées à la rapamycine variait de 2,6 à 4,3 fois les valeurs attendues, indiquant un enrichissement. Le RLI cytoplasmique dans les échantillons traités à la rapamycine était de 0,2 à 0,6 de l'attendu, suggérant un épuisement lorsque les particules se sont déplacées vers les régions membranaires. A titre de comparaison, chez les témoins, le RLI cytoplasmique était de 1,0 à 1,2 des valeurs attendues. Dans les échantillons FerriTagged, les particules ont été trouvées à des taux plus élevés que prévu dans les régions proximales de la membrane sans couche évidente de clathrine. Compte tenu de la spécificité du marquage, il est probable que ces particules représentent la clathrine FerriTagged qui est en cours d'assemblage/désassemblage. Ce travail indique que tout FerriTag associé à une structure subcellulaire particulière représente un véritable étiquetage, et que FerriTag non lié n'interfère pas avec la détection d'un véritable étiquetage FerriTag.

Détermination de la résolution d'étiquetage de FerriTag

La résolution de marquage fait référence à la précision avec laquelle la position détectée de la particule correspond à l'emplacement de la protéine marquée 2 . La distance maximale possible que la particule FerriTag pourrait être de la protéine marquée est théoriquement de 22 nm (Fig. 4a). Cependant, FerriTag peut adopter une conformation ou une pose plus compacte résultant en des longueurs observées plus courtes. Pour déterminer directement la résolution de marquage, nous avons FerriTagged la protéine transmembranaire CD8?? et des échantillons traités pour EM (Fig. 4b). La distance perpendiculaire du centre de la particule FerriTag à la membrane plasmique a été mesurée (médiane = 9,5 nm, N = 458 particules, fig. 4c). Pour interpréter la forme de cette distribution, nous avons effectué des simulations informatiques qui ont modélisé la détection de particules dans les sections EM (voir la note supplémentaire 3). Ces simulations indiquent que FerriTag peut exister dans un certain nombre d'états de longueur de 7 à 18 nm. La distribution a une large diffusion (FWHM ≈ 10 nm), ce qui signifie qu'en moyenne la particule sera détectée à 10 ± 5 nm de la protéine cible. Cette résolution dépasse celle du marquage immunogold traditionnel qui a une résolution de marquage de 18 nm en pré-encastrement ou de 21 nm sur la section 2 . Cet ensemble de données nous a également permis de déterminer directement le rapport signal sur bruit (SNR) pour FerriTagging (8,7 ± 0,1, moyenne ± s.e.m., Fig. 4d, voir la note supplémentaire 4). Le SNR élevé est encourageant pour les futures approches informatiques permettant de sélectionner automatiquement les particules et de quantifier les images des cellules FerriTagged.

La résolution d'étiquetage de FerriTagging est d'environ 10 nm. une Diagramme schématique pour montrer la configuration expérimentale pour mesurer la résolution d'étiquetage de FerriTag. FerriTagging de CD8-GFP-FKBP est montré par rapport à la membrane plasmique. Les domaines protéiques sont organisés de manière colinéaire, donnant une longueur totale maximale de 22 nm du bord de la membrane plasmique au centre de la particule de ferritine. b FerriTagging CD8-GFP-FKBP. Images de localisation (à gauche), imagerie de cellules vivantes de FerriTagging (au milieu) et images TEM (à droite). Les cellules ont été traitées avec de la rapamycine (200 nM) comme indiqué par la barre orange pleine. Barre d'échelle de microscopie optique 10 m et zoom ×12. Barre d'échelle de micrographie électronique 50 nm et zoom ×7.25. c Histogramme des observations expérimentales (rouge) avec une fonction de densité des valeurs simulées superposées (gris). La ligne pointillée indique la médiane de l'ensemble de données expérimentales, 9,8 nm (Nparticule = 458). Histogramme du rapport signal sur bruit mesuré à partir de cet ensemble de données (Nparticule = 389)

Cartographie à l'échelle nanométrique de HIP1R à l'aide de FerriTagging

Après avoir développé FerriTagging, nous avons ensuite voulu réaliser une cartographie contextuelle à l'échelle nanométrique d'une protéine d'intérêt pour répondre à une question de biologie cellulaire. La protéine 1 interagissant avec la Huntingtine (HIP1R), l'homologue humain de la levure Sla2p, peut se lier aux membranes, à la chaîne légère de la clathrine et à l'actine. Il existe sous deux conformations: étendu et coudé et plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer comment HIP1R relie la machinerie clathrine au cytosquelette d'actine 14,15,16,17,18,19. Pour tester ces modèles, nous avons déterminé la distribution à l'échelle nanométrique de HIP1R aux CCP en utilisant FerriTagging. Les cellules HeLa exprimant HIP1R-GFP-FKBP et FerriTag ont été traitées via notre flux de travail CLEM et des images MET de FerriTagged HIP1R sur des CCP ont été acquises (Fig. 5a). Nous avons collecté des images de CCP et segmenté le profil de la membrane plasmique et la position des particules FerriTag dans chacun (Fig. 5b, voir Analyse d'image dans Méthodes). En utilisant une moyenne spatiale, nous avons tracé la distribution de toutes les particules de manière symétrique autour d'un profil de fosse idéalisé pour la visualisation (Fig. 5c). Ces données ont révélé que la distribution de HIP1R est homogène sur toute la couronne du CCP. De plus, en définissant les bords du CCP, nous avons pu cartographier FerriTagged HIP1R distalement par rapport au CCP, c'est-à-dire dans les zones adjacentes de la membrane plasmique non revêtue. Ici, HIP1R a été marqué à une densité inférieure à celle du CCP lui-même (Fig. 5c, d). Fait intéressant, la distance entre les particules et la membrane plasmique était plus grande pour FerriTagged HIP1R au niveau de la fosse par rapport aux régions distales, une différence de 10 nm en moyenne (Fig. 5e). FerriTagging est à l'extrémité C-terminale de HIP1R et toute différence de distance à la membrane se traduit probablement par des changements de conformation de la molécule (Fig. 5f). Ces données suggèrent que HIP1R est dans une forme étendue au niveau du CCP, mais lorsqu'il est distal par rapport à la fosse, HIP1R est dans une conformation coudée (Fig. 5f).

Cartographie à l'échelle nanométrique de HIP1R à proximité de fosses recouvertes de clathrine. une FerriTagging HIP1R-GFP-FKBP. Images de localisation (à gauche), imagerie de cellules vivantes de FerriTagging (au milieu) et images TEM (à droite). Les cellules ont été traitées avec de la rapamycine (200 nM) comme indiqué par la barre orange pleine. Barre d'échelle de microscopie optique 10 m et zoom ×12. Barre d'échelle de micrographie électronique 50 nm et zoom ×7.25. b Profils membranaires segmentés manuellement (noir—puits, gris—distal) et particules FerriTag (rouge) à partir de micrographies électroniques HIP1R FerriTag. Une superposition alignée de tous les profils est affichée dans le coin inférieur droit. c Représentation spatialement moyenne de HIP1R lié à un CCP idéalisé (100 nm de diamètre) déterminé par la position des particules FerriTag dans les micrographies MET. Les emplacements FerriTag sont marqués par des croix, codés par couleur selon la distance à la membrane plasmique. Les particules les plus proches de la membrane dans la fosse ou dans les régions distales sont présentées séparément. Notez que la distribution est présentée de manière symétrique, c'est-à-dire que chaque particule apparaît deux fois. , e Nuages ​​de points de la fréquence de FerriTagged-HIP1R () et la proximité de FerriTagged-HIP1R avec la membrane plasmique (e). Les particules dans la fosse ou les régions distales sont tracées. Les barres indiquent la moyenne ± SD, p-les valeurs sont de Student t-test avec la correction de Welch. F Diagramme schématique de HIP1R, une molécule en forme de bâtonnet avec des domaines d'interaction pour la membrane, la clathrine et l'actine 14 . Modèle pour expliquer nos données : HIP1R est dans une conformation étendue lorsqu'il interagit avec la membrane, la clathrine et l'actine, et est dans une conformation plus courte/entortillée lorsqu'il n'est pas lié à la clathrine


Connaissances sur le microscope électronique à balayage

2. Théorie du canular du microscope électronique à balayage
En 1980, Margherita Guarducci, une épigraphiste de premier plan, a publié un livre affirmant que l'inscription avait été falsifiée par Francesco Martinetti, un marchand d'art, et Helbig, connus pour avoir collaboré à des relations louches. Sa présentation en 1887, a-t-elle affirmé, était en fait un canular perpétré pour faire avancer la carrière des deux hommes. C'était l'accusation la plus formelle mais pas la première du genre : Georg Karo avait dit que Helbig lui avait dit que la fibule avait été volée à la Tomba Bernardini de Palestrina.
.

3. Espèces de microscope électronique à balayage
Les espèces du genre Dendronotus comprennent :
Dendronotus albopunctatus Robilliard, 1972
Dendronotus albus MacFarland, 1966 (synonyme : Dendronotus diversicolor Robilliard, 1972)
Dendronotus arcticus Korshunova, Sanamyan, Zimina, Fletcher & Martynov, 2016
Dendronotus bathyvela Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & Korshunova, 2020
Dendronotus claguei Valds, Lundsten & N. G. Wilson, 2018
Dendronotus comteti Valds & Bouchet, 1998
Dendronotus dalli Bergh, 1879
Dendronotus elegans A. E. Verrill, 1880
Dendronotus europaeus Korshunova, Martynov, Bakken & Picton, 2017
Dendronotus frondosus (Ascanius, 1774) (synonymes : D. arborescens, D. reynoldsi)
Dendronotus gracilis Baba, 1949
Dendronotus iris J.G. Cooper, 1863 (synonyme D. giganteus)
Dendronotus jamsteci Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & Korshunova, 2020
Dendronotus kalikal Ekimova, Korshunova, Schepetov, Neretina, Sanamyan & Martynov, 2015
Dendronotus kamchaticus Ekimova, Korshunova, Schepetov, Neretina, Sanamyan & Martynov, 2015
Dendronotus lacteus (W. Thompson, 1840)
Dendronotus nordenskioeldi Korshunova, Bakken, Grtan, Johnson, Lundin & Martynov, 2020
Dendronotus patricki Stout, N.G. Wilson & Valds, 2011
Dendronotus primorjensis Martynov, Sanamyan & Korshunova, 2015
Dendronotus robilliardi Korshunova, Sanamyan, Zimina, Fletcher & Martynov, 2016
Dendronotus robustus Verrill, 1870
Dendronotus rufus O'Donoghue, 1921
Dendronotus subramosus MacFarland, 1966
Dendronotus velifer G. O. Sars, 1878
Dendronotus venustus MacFarland, 1966
Dendronotus yrjargul Korshunova, Bakken, Grtan, Johnson, Lundin & Martynov, 2020
Dendronotus zakuro Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & Korshunova, 2020Espèce mise en synonymie
Dendronotus diversicolor Robilliard, 1972 : synonyme de Dendronotus albus MacFarland, 1966
Dendronotus luteolus Lafont, 1871 : synonyme de Dendronotus frondosus (Ascanius, 1774)
Dendronotus nanus Marcus & Marcus, 1967 : synonyme de Dendronotus iris J. G. Cooper, 1863
Dendronotus stellifer A. Adams & Reeve in A. Adams, 1848 : synonyme de Bornella stellifer (A. Adams & Reeve in A. Adams, 1848)
Dendronotus tenellus A. Adams & Reeve in A. Adams, 1848 : synonyme de Bornella stellifer (A. Adams & Reeve in A. Adams, 1848)

4. Kazachstania yasuniensis du microscope électronique à balayage
Kazachstania yasuniensis est une levure récemment isolée. Cet organisme fait partie du genre Kazachstania, qui peut être trouvé dans une grande variété d'habitats tels que les aliments fermentés, les animaux, les eaux usées, etc.

5. Cryomicroscopie électronique à balayage du microscope électronique à balayage
La cryomicroscopie électronique à balayage (CryoSEM) est une forme de microscopie électronique dans laquelle un échantillon hydraté mais fixé cryogéniquement est imagé sur la platine froide d'un microscope électronique à balayage dans une chambre cryogénique. Le refroidissement est généralement réalisé avec de l'azote liquide. La cryoSEM d'échantillons biologiques à haute teneur en humidité peut être effectuée plus rapidement avec moins d'étapes de préparation d'échantillons que la SEM conventionnelle. De plus, les processus de déshydratation nécessaires pour préparer un échantillon biologique pour une chambre SEM conventionnelle créent de nombreuses distorsions dans le tissu conduisant à des artefacts structurels lors de l'imagerie.

6. Découverte du microscope électronique à balayage
La fibule a été présentée au public en 1887 par Wolfgang Helbig, un archéologue. Selon certaines sources, Helbig n'a pas expliqué comment il en était venu à acquérir l'artefact à l'époque, bien que d'autres déclarent que la fibule « a d'abord été portée à la connaissance du public dans trois courts articles dans les Rmische Mitteilungen de 1887 où il est dit ont été achetés à Palestrina par un ami de Helbig en 1871, soit cinq ans avant la découverte du tombeau" le tombeau en question étant le tombeau Bernardini dont le trésor de la fibule a été revendiqué plus tard comme faisant partie

7. Praeneste péroné du microscope électronique à balayage
La fibule de Praeneste (la "broche de Palestrina") est une fibule ou une broche en or, aujourd'hui conservée au Museo Preistorico Etnografico Luigi Pigorini à Rome. La fibule porte une inscription en vieux latin. Au moment de sa découverte à la fin du XIXe siècle, il a été accepté comme le plus ancien spécimen connu de la langue latine. L'authenticité de l'inscription a depuis été contestée. Cependant une nouvelle analyse réalisée en 2011 la déclare authentique « hors de tout doute raisonnable » et datant de la période orientalisante, dans la première moitié du VIIe siècle av.

8. Otto Klemperer (physicien) du microscope électronique à balayage
Otto Ernst Heinrich Klemperer (18991987) était un physicien expert en optique électronique. Il obtint son doctorat de la Humboldt-Universitt zu Berlin en 1923. Son directeur de thèse était Hans Geiger. Il a continué à travailler avec Geiger dans les années 1930.
Klemperer a été co-inventeur en 1928 du compteur à billes Geiger-Klemperer, « la première avancée majeure dans la conception des compteurs proportionnels ». Au cours des années 1930, il a travaillé au laboratoire Cavendish de l'Université de Cambridge sur les divergences entre la théorie de la désintégration de Fermi et les propriétés de rayonnement observées du rubidium et du polonium. Il a ensuite été professeur adjoint et lecteur en physique à l'Imperial College de Londres, où il a écrit la troisième édition de son livre sur l'optique électronique avec Mike Barnett.
Le chef d'orchestre Otto Klemperer était le cousin de son père.
Son oncle était le romaniste Victor Klemperer.

9. Isolement du microscope électronique à balayage
Kazachstania yasuniensis a été isolé en Equateur et dans l'archipel des Galpagos dans des régions arboricoles. Sept souches du genre Kazachstania ont été isolées afin de fournir une taxonomie complète pour la nouvelle espèce. Ces échantillons ont été cultivés sur milieu éthanol à 7,6 % (Sniegowski et al. 2002). Ils ont été isolés soit à partir de bois pourri, de terre ou de fruits en décomposition. Sur la base de l'endroit où ces espèces ont été isolées, les chercheurs ont conclu que K. yasuniensis réside très probablement dans un habitat arboricole. Les souches ont été collectées en Amazonie équatorienne, ainsi que dans la forêt de Scalesia de l'île de Santa Cruz dans les îles Galpagos.
Bien qu'aucune coloration de Gram n'ait été réalisée, à l'aide d'un microscope électronique à balayage, les cellules de K. yasuniensis se sont avérées ovoïdes et soit simples, appariées, soit en chaînes courtes ou en groupes de cellules.

10. Crewe (nom de famille) du microscope électronique à balayage
Crewe ou Crew est un nom de famille d'origine ancienne galloise.
Les personnes portant ce nom de famille comprennent
Albert Crewe (19272009), physicien et inventeur du microscope électronique à transmission à balayage
Bertie Crewe (18601937), décorateur de théâtre britannique
Bob Crewe (19302014), American songwriter, singer, manager, and record producer
Francis Albert Eley Crew (1886-1973), British animal geneticist
Sir George Harpur Crewe, 8th Baronet (17951844), English Tory politician
Harvey and Jeannette Crewe, murder victims in New Zealand
Henry Harpur Crewe (18281883), English clergyman and naturalist
Hungerford Crewe, 3rd Baron Crewe (18121894)
John Crewe (disambiguation), various persons of that name, including:
John Crewe, 1st Baron Crewe (17421829)
John Crewe, 2nd Baron Crewe (17721835)
Quentin Crewe (19261998), English journalist, author and adventurer
Ranulph Crewe (15581646), English judge and Chief Justice of the King's Bench
Thomas Crewe (15651634), English Member of Parliament and lawyer, Speaker of the House of Commons
Amanda Crew, Canadian film and television actress
Gary Crew, Australian writer of young adult fiction
Nathaniel Crew, 3rd Baron Crew, Bishop of Oxford (1671 to 1674) and Bishop of Durham (1674 to 1721)
Rudy Crew, former Superintendent of Schools of Miami-Dade County Public Schools in Florida, USA

11. Further reading of scanning electron microscope
Authors who argue that the Fibula is a forgery:
Hamp, Eric P. (1981). "Is the Fibula a Fake?". American Journal of Philology. 102 (2): 1513. doi:10.2307/294308. JSTOR294308.
Gordon, Arthur E. (1983). Illustrated Introduction to Latin Epigraphy. Berkeley/Los Angeles/London. ISBN0520038983.
Bonfante, Larissa (1986). Etruscan Life and Afterlife: A Handbook of Etruscan Studies. Detroit: Wayne State University Press.Authors who argue that the Fibula is authentic:
Lehmann, Winfred P. (1993). Historical Linguistics (3rd ed.). Routledge.
Wachter, R. (1987). Altlateinische Inschriften. Sprachliche und epigraphische Untersuchungen zu den Dokumenten bis 150 v. Chr. Bern etc.
Formigli, E. (1992). "Indagini archeometriche sull'autenticit della Fibula Praenestina". MDAI(R). 99: 32943, Taf. 8896.
Hartmann, Markus (2005). Die frhlateinischen Inschriften und ihre Datierung: Eine linguistisch-archologisch-palographische Untersuchung (in German). Bremen: Hempen. ISBN978-3-934106-47-5.
"La Fibula Prenestina". Bullettino di Paletnologia Italiana (in Italian). 99. 2014.

12. Anatomy of scanning electron microscope
Snails in this genus create and use love darts as part of their mating behavior.
The scanning electron microscope images on the left show (above) the lateral view of the love dart of Humboldtiana nuevoleonis, scale bar 500 m (0.5mm) and (below) a cross section of the dart, scale bar 50 m.

13. Utricularia meyeri of scanning electron microscope
Utricularia meyeri is a medium-sized, probably perennial carnivorous plant that belongs to the genus Utricularia. It is endemic to western Goias and eastern Mato Grosso in central Brazil. U.meyeri grows as a terrestrial plant in bogs and seasonally flooded swamps and grasslands at altitudes from 400m (1,312ft) to around 600m (1,969ft). It was originally described by Robert Knud Friedrich Pilger in 1901 and later reduced to synonymy under U.erectiflora by Peter Taylor in 1967. He later reevaluated his decision on the basis of scanning electron microscope images of the seed of the two species.

14. Replicas of scanning electron microscope
Replicas of the fibula are held by the National Roman Museum's Museum of Epigraphy at the Baths of Diocletian in Rome, and also by the Arthur M. Sackler Museum at Harvard in Cambridge, Massachussetts.

15. Characteristics of scanning electron microscope
Morphologically, standard methods such as growth temperature testing using yeast extract-malt extract agar cultivation and sporulation tests on various agars were used. As far as physiological characterization goes, the novel species differed from its close relatives in that it absorbed trehalose and ethanol, while growing on ethylamine hydrogen chloride and sodium chloride. It was also unable to grow at 37C and absorb glucose, and could absorb sucrose, all of which are physiological aspects that differ from its close relatives.
The Si value was calculated for the species as well. A higher Si value indicates a more specialized species. The value for K. yasuniensis was 0.62, and therefore characterized with the majority of yeast species found in highly specialized environments.
Kazachstania yasuniensis was found to absorb and metabolize glucose, sucrose, raffinose, galactose, trehalose, cadaverine, ethylamine hydrochloride, and ethanol. It could not grow on inulin, melibiose, lactose, maltose, melezitose, methyl - d-glucoside, starch, cellobiose, salicin, l-sorbose, l-rhamnose, d-xylose, l-arabinose, d-arabinose, d-ribose, methanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, d-mannitol, d-glucitol, inositol, dl-lactate, succinate, citrate, d-glucosamine, glucono- d-lactone, ysine, nitrate, xylitol, or 50% glucose/yeast extract. The organism proliferated at 30C, but there was no growth at 37C.
Multigene sequencing needs to be performed in order to establish clearer boundaries between yeast species. This is a very novel species and there is still much to be discovered.

16. Dendronotus of scanning electron microscope
Dendronotus is a genus of sea slugs, nudibranchs, marine gastropod molluscs in the superfamily Tritonioidea.
This genus is within the clade Cladobranchia (according to the taxonomy of the Gastropoda by Bouchet & Rocroi, 2005).

17. Date and inscription of scanning electron microscope
The fibula was thought to originate from the 7th century BC. It is inscribed with a text that appears to be written in Old Latin or Proto-Latino-Faliscan (shown by MED /med/ as an accusative instead of ablative), here transcribed to Roman letters:
MANIOS MED FHEFHAKED NVMASIOIThe reconstructed Proto-Italic ancestor would have been:
*Mnjos m fefaked NumazjiThe equivalent Classical Latin sentence obtained by applying the appropriate differences between Old Latin and Classical Latin would probably have been:
*MANIVS ME FECIT NVMERIOtranslated as:
Manius made me for Numerius

18. Chilostoma cingulatum of scanning electron microscope
Chilostoma cingulatum is a species of medium-sized, air-breathing land snail, a terrestrial pulmonate gastropod mollusk in the family Helicidae, the true snails.
Subspecies
Chilostoma cingulatum adamii (Pini, 1876)
Chilostoma cingulatum alzonai K. L. Pfeiffer, 1951
Chilostoma cingulatum anauniense (De Betta, 1852)
Chilostoma cingulatum anconae (Gentiluomo, 1868)
Chilostoma cingulatum appelii (Kobelt, 1876)
Chilostoma cingulatum asperulum (Ehrmann, 1910)
Chilostoma cingulatum baldense (Rossmssler, 1839)
Chilostoma cingulatum bizona (Rossmssler, 1842)
Chilostoma cingulatum boccavallense K. L. Pfeiffer, 1951
Chilostoma cingulatum carrarense (Strobel, 1852)
Chilostoma cingulatum cingulatum (S. Studer, 1820)
Chilostoma cingulatum colubrinum (De Cristofori & Jan, 1832)
Chilostoma cingulatum frigidescens (Del Prete, 1879)
Chilostoma cingulatum frigidissimum (Paulucci, 1881)
Chilostoma cingulatum frigidosum (Pollonera, 1890)
Chilostoma cingulatum gobanzi (Frauenfeld, 1867)
Chilostoma cingulatum hermesianum (Pini, 1874)
Chilostoma cingulatum infernale (P. Hesse, 1931)
Chilostoma cingulatum insubricum (De Cristofori & Jan, 1832)
Chilostoma cingulatum medoacense (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum montanum (Paulucci, 1881)
Chilostoma cingulatum nicatis (Costa, 1836)
Chilostoma cingulatum nicolisianum (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum peregrini Falkner, 1998
Chilostoma cingulatum philippii (Kobelt, 1905)
Chilostoma cingulatum preslii (Rossmssler, 1836)
Chilostoma cingulatum sentinense (Piersanti, 1833)
Chilostoma cingulatum transiens (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum anauniense
Chilostoma cingulatum baldense
Chilostoma cingulatum colubrinum
Chilostoma cingulatum nicatis
Chilostoma cingulatum preslii


Informations sur l'auteur

Present address: Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Affiliations

INM — Leibniz Institute for New Materials, Saarbrücken, Germany

Department of Physics, Saarland University, Saarbrücken, Germany

Ernst Ruska-Centre for Microscopy and Spectroscopy with Electrons and Peter Grünberg Institute, Forschungszentrum Jülich, Jülich, Germany

Lothar Houben & Rafal E. Dunin-Borkowski

Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

IBM T. J. Watson Research Center, Yorktown Heights, NY, USA

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Contributions

All authors contributed to the discussion of content and researched data for the article. R.E.D.-B. and L.H. wrote the section on aberration correction. N.dJ. and F.M.R. wrote the sections on spatial and temporal resolution. All authors edited the article prior to submission.

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