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2.3 : Préparer l'ARN par IVT - Biologie

2.3 : Préparer l'ARN par IVT - Biologie



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Introduction

Jusqu'à présent, vous avez préparé l'ADN codant pour les fragments d'aptamère 6-5 et 8-12. Cependant, c'est la structure secondaire du ARN qui permet en fait à la séquence 8-12 de se lier à l'hème. Afin de fabriquer de l'ARN à partir de l'ADN, vous effectuerez une in vitro réaction de transcription (IVT).

Que faut-il pour créer de l'ARN à partir de l'ADN ? En PCR, vous avez utilisé une ADN polymérase thermostable et des dNTP (désoxynucléotides triphosphates) pour fabriquer votre ADN. Dans un IVT, vous utiliserez à la place une ARN polymérase et des NTP (nucléotides triphosphates). La polymérase est dérivée du bactériophage T7, et nécessite que l'ADN à copier contienne la séquence du promoteur T7, ou TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG. Les conditions du tampon sont également quelque peu différentes (consultez les listes de réactifs à la fin de chaque journée), mais les deux contiennent l'important cofacteur Mg2+. Enfin, un IVT contient de la pyrophosphatase, car il s'est avéré empiriquement qu'il augmente l'efficacité. Le pyrophosphate est produit pendant l'IVT, donc selon le principe de Le Chatelier, l'achèvement de la réaction peut être amélioré en éliminant ce produit.

Voyons maintenant comment un IVT s'intègre dans le schéma global de SELEX, ou évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel. SELEX a été signalé simultanément par deux groupes en 1990 :

Ellington et Szostak décrit l'ARN qui se lie pour sélectionner de petites molécules aromatiques, tandis que Tuerk et or ARN isolé lié à une ADN polymérase. Comme le montre la figure de droite, en raison de la stabilité de l'ADN, on commence généralement avec une bibliothèque d'ADN plutôt que directement avec une bibliothèque d'ARN. L'ADN est copié en ARN par transcription, et le pool d'ARN résultant est passé sur une colonne d'affinité à laquelle est lié le ligand d'intérêt. Les aptamères qui ne se lient pas sont éliminés en faisant circuler du tampon dans la colonne. Ensuite, l'ARN qui se lie au ligand est lavé, soit en utilisant un ligand libre comme compétiteur, soit parfois par d'autres changements dans les conditions du tampon (par exemple, la concentration en sel ou le pH). Ce pool d'ARN est copié dans l'ADN par transcription inverse, puis amplifié par PCR, souvent à l'aide d'un kit en une seule étape de nos jours. Après RT-PCR, la nouvelle bibliothèque (contenant probablement beaucoup moins d'espèces d'ADN que la bibliothèque d'origine) est à nouveau transcrite en ARN. Maintenant, la nouvelle bibliothèque peut être encore affinée par une deuxième sélection de colonne.

Une étape facultative mais souvent importante consiste à effectuer une sélection négative. Pour débarrasser le pool d'ARN des aptamères qui se lient de manière non spécifique au matériau de la colonne, on peut incuber la bibliothèque avec une résine de colonne dépourvue de ligand mais qui est par ailleurs identique à la résine d'affinité. Après tout, il serait dommage de penser que l'on a trouvé plusieurs aptamères se liant à l'hème, seulement pour découvrir qu'ils se lient en fait à des billes d'agarose ! Le surnageant de la sélection négative est ensuite utilisé directement dans la sélection positive. Parfois, plusieurs sélections négatives peuvent être appropriées. Par exemple, si l'on souhaite trouver un aptamère qui se lie à un ligand particulier mais ne pas à plusieurs ligands similaires, on pourrait effectuer des sélections négatives en utilisant des colonnes d'affinité présentant ces ligands indésirables. Peu importe combien de précautions on prend, les statistiques des grands nombres suggèrent qu'il y aura toujours des faux positifs : des séquences d'ARN qui parviennent à être amplifiées de manière détectable, mais ne se lient pas au ligand d'intérêt.

Après une ou plusieurs sélections de colonnes, on peut utiliser le clonage pour sélectionner des espèces d'ARN individuelles pour le séquençage ou pour les tests dans un essai fonctionnel. Encore une fois, ligaturer la banque d'ADN dans un plasmide qui peut être exprimé dans des bactéries est plus facile que de travailler avec l'ARN. L'ADN peut être isolé à partir de colonies individuelles de bactéries qui contiennent chacune un seul ADN codant pour un aptamère, puis séquencé et transcrit en ARN si désiré. Une bibliothèque de départ typique peut avoir 10^13 à 10^15 séquences ! Dans les premières expériences de liaison de Szostak, les molécules qui se sont liées aux colorants aromatiques ont été enrichies de moins de 1 % à plus de 50 % de la population de la bibliothèque d'ARN après quatre cycles de sélection, et la population unique a été réduite à environ 100 à 100 000 séquences. Dans notre cas, nous connaissons déjà les séquences des deux aptamères en question, et nous nous intéressons simplement à leur ratio après un tour de sélection de colonnes. Le test fonctionnel qui peut indiquer ce rapport mesure la liaison de l'aptamère à l'hème par spectrophotométrie.

L'IVT fonctionnera pendant toute la période de laboratoire. En attendant, nous discuterons d'un article de revue, à la fois pour en savoir plus sur les aptamères d'ARN et pour devenir à l'aise dans la lecture et la discussion de la littérature scientifique primaire. Dans 2-3 semaines, vous présenterez chacun un article de votre côté.

Protocoles

Parce que vous préparez l'ARN, vous devrez prendre des précautions particulières aujourd'hui et pour le reste du module. L'ARN est remarquablement différent de l'ADN dans sa stabilité. Par conséquent, il est plus difficile de travailler avec l'ARN en laboratoire. Ce ne sont pas les techniques elles-mêmes qui sont difficiles ; en effet, de nombreuses manipulations sont presque identiques à celles utilisées pour l'ADN. Cependant, l'ARN est rapidement et facilement dégradé par les RNases qui existent partout. Il existe plusieurs règles pour travailler avec l'ARN. Ils amélioreront vos chances de réussite. Veuillez les suivre tous.

  • Utilisez de l'eau tiède sur une serviette en papier pour laver le matériel de laboratoire, comme les microfuges, avant de commencer votre expérience. Essuyez-les ensuite avec la solution "RNase-away".
  • Portez des gants lorsque vous touchez tout ce qui touchera votre ARN.
  • Changez souvent vos gants.
  • Avant de commencer votre expérience, nettoyez votre zone de travail en enlevant tout encombrement. Essuyez le plan de travail avec de l'eau tiède, puis "RNase-away", puis posez un nouveau morceau de papier de paillasse.
  • Utiliser des solutions dédiées à l'ARN et si possible des pipetteurs dédiés à l'ARN.
  • Procurez-vous une nouvelle boîte d'embouts de pipette dans la zone des matériaux d'ARN et étiquetez leur couvercle « RNase FREE » si le couvercle n'est pas encore étiqueté.

Partie 1 : Transcription In Vitro

Le tableau ci-dessous répertorie la quantité de chaque composant de réaction nécessaire pour un IVT de 80 L. Tout d'abord, vous devez calculer la quantité totale d'IVT Master Mix à réaliser (2 rxns plus 10% de dépassement) et vérifier vos calculs avec le corps professoral si vous le souhaitez. Ensuite, vous pouvez aliquoter la quantité appropriée de Master Mix dans un certain nombre de tubes eppendorf, puis ajouter l'ADN correspondant à chaque tube étiqueté.

RÉACTIFQUANTITÉ POUR 1 RÉACTION (μL)MONTANT POUR 2 RÉACTIONS + 10%
Tampon G7 (actions 2.5X)32
1N KOH4.48
Pyrophosphatase4
NTP22.4
polymérase T74
ADN13.1N / A

Placez vos tubes de réaction sur le bloc chauffant à 37 °C et notez l'heure dans votre cahier ainsi que sur la feuille de la banquette avant. Après 4 heures, les réactions seront congelées à – 20 °C jusqu'à la prochaine fois. Lorsque tout le monde sera prêt, nous commencerons la discussion sur l'article de la revue.

Partie 2 : Choisir les conditions de colonne

Avant de partir aujourd'hui, vous et votre partenaire devez vous inscrire à l'un des protocoles de sélection de colonnes répertoriés dans le tableau suivant :

PROTOCOLE #PAIRE D'ÉTUDIANTS8-12%N° DE LAVAGE (PARAMÈTRE 1)N° DE LAVAGE (PARAMÈTRE 2)NOTEZ LES CHANGEMENTS À PLANIFIER ICI
12424
22816
310424
410816
550424
650816
750424

Discussion d'articles de revues

Nous discuterons de ce papier :

  • Rusconi, C.P., et al. "Contrôle médié par un antidote d'un aptamère anticoagulant in vivo." Biotechnologie naturelle 22, non. 11 (novembre 2004) : 1423-8.

Les articles scientifiques sont denses et souvent longs à lire et à comprendre, mais avec de la pratique, vous trouverez des stratégies qui améliorent votre efficacité de compréhension. Voici un conseil pour vous aider à démarrer : lorsque vous lisez les résultats récemment publiés, assurez-vous de vous référer fréquemment aux chiffres associés, car les informations visuelles sont souvent plus faciles à assimiler que les descriptions purement verbales.

Contexte technique

Plusieurs termes et essais dans Rusconi, et al. le papier peut vous être inconnu. (Sur cette note, "test" n'est qu'un terme qui désigne un type de mesure. Par exemple, un test de viabilité cellulaire mesure le nombre de cellules vivantes dans un échantillon.) Nous fournirons ici quelques informations générales sur des sujets sélectionnés.

  • Bol fait référence à une injection unique de médicament, par opposition à une perfusion continue (via une ligne IV).
  • Pharmacocinétique est l'étude de la route qu'emprunte un médicament dans l'organisme, à la fois où il circule et comment il est éliminé.
  • Pharmacodynamique est l'étude des effets réels, à la fois intentionnels et non intentionnels, du médicament sur le receveur, ainsi que du mécanisme du médicament et de la cinétique au niveau moléculaire.
  • Plasma est du sang avec les cellules enlevées. (Le sérum est du sang sans cellules ni facteurs de coagulation.)

Notez qu'il existe plusieurs voies pour la coagulation du sang. Un Test APTT mesure l'activité de la voie qui dépend de la présence du facteur de coagulation IX. Dans les travaux de Rusconi, un tampon avec ou sans aptamère a été mélangé avec un échantillon de test plasma, puis activé avec des phospholipides et des ions calcium. L'ajout d'un anticoagulant devrait augmenter le temps nécessaire à la formation d'un caillot dans le mélange activé. Les dosage TP, d'autre part, mesure l'activité d'une voie indépendante du facteur IX. Dans ce cas, la thromboplastine et les ions calcium sont utilisés pour l'activation plasmatique.

Sujets de discussion

L'écriture

En lisant l'article de Rusconi et al., tenez compte non seulement de son contenu scientifique, mais aussi du style d'écriture des auteurs (peut-être pas en une seule lecture !). Référez-vous à notre Lignes directrices pour la rédaction de votre recherche Esquissez les réponses aux questions ci-dessous (à droite sur le papier si vous le souhaitez). Vos réponses ne seront pas collectées, mais vous pourrez être appelé en discussion pour partager vos idées.

  • Quelle partie du texte correspond à une section d'introduction ? Quel est le sujet et/ou la fonction de chaque paragraphe ? A quel(s) objectif(s) les citations servent-elles ?
  • Quelle partie du texte correspond à une section Résultats ? Pouvez-vous trouver un ou plusieurs exemples de paragraphes avec des phrases d'introduction et de conclusion efficaces, selon notre Lignes directrices pour les résultats? Y a-t-il des parties des résultats qui, selon vous, appartiennent plutôt à la discussion, selon notre Lignes directrices pour les discussions et résultats vs discussions?
  • Quelle partie du texte correspond à une section Discussion ? Quel est le sujet et/ou la fonction de chaque paragraphe ? À quel(s) but(s) les citations servent-elles?

Teneur

Lorsque vous arriverez au laboratoire aujourd'hui, chaque groupe se verra attribuer l'un des sujets suivants à présenter et à discuter avec le reste de la classe. Vous devriez être quelque peu familier avec l'ensemble de Rusconi, et al. papier maintenant, mais vous aurez un peu de temps en classe pour vous rafraîchir la mémoire et devenir l'expert résident dans l'un des domaines suivants.

  • Introduction et Figure 1a
    • Quels sont les avantages d'utiliser un aptamère comme médicament anticoagulant ?
    • Quels travaux connexes les auteurs ont-ils déjà effectués et quelle lacune de recherche est comblée par ce nouvel article ?
    • Résumer l'échantillon et les aptamères de contrôle utilisés dans cette étude. Quelle est la cible de l'aptamère ?
  • Figure 1, b-e
    • Décrivez les principales conclusions présentées dans cette figure.
    • Quel était le but de tester l'aptamère contre plusieurs sources animales ?
  • Figure 2, a-c
    • Décrivez les principales conclusions présentées dans cette figure.
    • Pourquoi les auteurs ont-ils fait ces expériences, s'ils disposaient déjà des données de la figure 1c ?
  • Figure 2, d-f
    • Décrivez les principaux résultats présentés dans cette figure.
    • Comment les auteurs ont-ils fait la distinction entre deux hypothèses sur l'action puissante de l'antidote ?
  • figure 3
    • Décrivez les principaux résultats présentés dans cette figure.
    • Brièvement, qu'est-ce qu'un thrombus, et dans quelles conditions est-il susceptible de se former ? (Peut nécessiter des recherches en dehors du papier.)
    • Quelles précautions les auteurs ont-ils prises pour éviter les biais lors de la collecte des données (voir Méthodes) ?
  • Figure 4
    • Décrivez les principaux résultats présentés dans cette figure.
    • Brièvement, qu'est-ce qu'une P-value ? (Peut nécessiter des recherches en dehors du papier.)
    • A quoi fait référence le « véhicule » (voir Méthodes) et quel est son rôle ?
  • Conclure
    • Comment le potentiel de l'aptamère en tant que médicament se compare-t-il à l'état de l'art actuel ?
    • En bref, recherchez dans PubMed si Rusconi, et al. avoir publié d'autres études sur les aptamères décrits ici, lu le ou les résumés et résumer tout progrès.

Pour la prochaine fois

  1. Jour 4 de ce module est sur le point de durer longtemps, vous devriez donc lire l'intégralité du protocole et peut-être préparer une partie de votre cahier de laboratoire à l'avance. De plus, pour gagner du temps plus tard, vous devez préparer une feuille de calcul automatisée (par exemple, dans Excel) qui effectuera les calculs requis pour ce jour-là. Votre feuille de travail doit faire ce qui suit, et une copie doit être remise en utilisant les numéros fictifs fournis :
    • La feuille de calcul doit accepter les lectures d'absorbance à 260 nm et 280 nm pour les échantillons d'ARN.
      • Numéros fictifs : 0,524, 0,255 pour l'échantillon 1 ; 0,427, 0,212 pour l'échantillon 2.
    • Le premier calcul devrait être le rapport 260:280.
    • Le paramètre suivant que l'utilisateur doit pouvoir spécifier est le facteur de dilution de l'ARN. Calculez ce que cela est basé sur le protocole du jour 4.
      • Si vous ne pouvez pas le comprendre, utilisez une valeur de 200 pour le moment.
    • Le prochain calcul devrait être la concentration d'ARN en g/mL. Trouvez le facteur de conversion de l'absorbance en concentration d'ARN dans le protocole du jour 4.
    • Calculez maintenant la concentration d'ARN en M, en supposant que l'échantillon 1 est 6-5 et l'échantillon 2 est 8-12 aptamère. (Les poids moléculaires sont répertoriés dans - vous l'avez deviné ! - le protocole du jour 4.)
    • L'utilisateur devrait maintenant être en mesure de saisir le volume d'ARN dont il dispose. Utilisez 75 L pour les deux échantillons pour l'instant.
    • Calculer le nombre total de nmoles d'ARN dans chaque échantillon.
    • Calculer le volume total de l'ARN devrait être à une concentration de 8 M.
    • Enfin, calculez le volume à ajouter à l'ARN existant pour atteindre cette concentration.
    • Dans un endroit séparé sur votre feuille (ou manuellement), calculez le volume d'une solution de 8 M requis pour avoir exactement 1,4 nmol d'ARN.
  2. Préparez une figure illustrant les résultats de votre gel PCR (à partir du jour 2) avec une légende appropriée. Écrivez également la partie de vos résultats (environ un paragraphe) décrivant cette expérience.
  3. Pour vous assurer que vous progressez régulièrement dans la tâche de calcul, vous devez commencer l'analyse MEME (exercice et question 1) et remettre un brouillon de la figure associée.
  4. Complétez la première partie des exercices d'écriture du document du jour 2. Jargon #2, Lisibilité #2, et Brièveté #4 sont dus le Jour 4; le reste des exercices est dû au jour 5.

Liste des réactifs

  • Tampon G7 (1X, conc final)
    • 200 M HEPES-KOH, pH 7,5
      • HEPES = acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique
    • 2 mM de spermidine
    • 40 mM de dithiothréitol (DTT)
    • 30 mM de MgCl2
    • 100 g/mL d'albumine de sérum bovin (BSA)
  • 1N KOH
  • Pyrophosphatase, 100 U/mL dans
    • HEPES-KOH 100 mM, pH 7,5
    • TNT 1 mM
    • 50% de glycérol
  • ARN polymérase T7
    • gène exprimé dans un plasmide pQE30 (arrêté, originaire de Qiagen)
    • purifié à partir d'E. coli

Conseils pour un nettoyage d'ARN réussi à l'aide des kits de nettoyage d'ARN Monarch ®

Une purification réussie de l'ARN à l'aide du kit Monarch Total RNA Mini Prep peut être facilement accomplie en suivant ces conseils utiles.

Partie 1 avant votre préparation

1.1 Éliminer les RNases de l'environnement de travail

Avant votre préparation. Il est important de travailler dans un environnement exempt de RNases. Portez toujours des gants, utilisez des vêtements en verre et en plastique sans RNase et nettoyez vos zones de travail. Nous vous recommandons d'essuyer votre plan de travail avec un agent de nettoyage tel que RNaseZAP.

1.2 Conserver correctement les échantillons d'ARN

Pour maintenir l'intégrité de l'ARN de votre échantillon, avant la préparation, les échantillons doivent être congelés au moment de la récolte ou protégés par un réactif dédié tel que le réactif de protection Monarch DNA and RNA, qui est inclus dans notre kit. Les culots de cellules cultivées sont des aliquotes de sang conservées avec ce réactif de protection, doivent être soigneusement mélangés par vortex ou pipetage avant le stockage.

De petits morceaux de tissu de moins de 20 mg peuvent être stockés directement dans le réactif de protection. Cependant, les échantillons de tissus plus volumineux doivent être homogénéisés dans le réactif de protection avant le stockage. Si des échantillons ont été conservés dans le réactif de protection, ne retirez pas le liquide avant le traitement, car le réactif de protection commence également la lyse de l'échantillon.

1.3 Éviter la décongélation des échantillons

Il est important d'éviter de décongeler votre échantillon afin de préserver son intégrité avant l'extraction de l'ARN. Les cellules cultivées congelées peuvent être décongelées brièvement avant l'ajout du tampon de lyse d'ARN, mais la plupart des autres types d'échantillons ne doivent pas être décongelés en l'absence du réactif de protection ou du tampon de lyse. Ces échantillons comprennent des tissus, du sang, des bactéries, des levures et des plantes.

1.4 Maximisez votre rendement en assurant une homogénéisation complète

Assurez-vous que vos échantillons sont complètement perturbés et homogénéisés afin de libérer tout l'ARN et de maximiser votre rendement. L'homogénéisation mécanique, par exemple, avec un homogénéisateur à billes, peut augmenter vos rendements au-delà de ceux produits par la digestion de la protéinase K seule lorsque vous travaillez avec des tissus. L'homogénéisation mécanique est également recommandée pour les échantillons difficiles à lyser tels que les plantes, les bactéries et les levures.

1.5 Plusieurs cycles d'homogénéisation peuvent être recommandés

Lors de l'utilisation de la lyse et de l'homogénéisation mécaniques, plusieurs cycles d'homogénéisation peuvent être recommandés. Si vous utilisez plusieurs tours, placez votre échantillon sur de la glace pendant environ une minute entre les tours pour éviter que votre échantillon ne surchauffe.

1.6 Pour les tissus ou les leucocytes Préchauffer le bloc chauffant

Si vous travaillez avec des tissus ou des leucocytes, il peut être utile de préchauffer votre bloc chauffant à 55 degrés Celsius avant de commencer votre préparation, afin que le bloc chauffant soit à la bonne température lorsque vous arriverez à l'incubation de la protéinase K. Veuillez noter que lorsque vous travaillez avec du sang total de mammifère, l'incubation de la protéinase K est effectuée à température ambiante.

1.7 Préparer le Master Mix

Nous vous recommandons également de préparer un mélange maître de tampon de réaction DNase I et DNase I avant de commencer si vous effectuez plusieurs préparations à la fois.

Partie 2 pendant votre préparation

2.1 Suivre les lignes directrices de l'ONÉ

Assurez-vous de suivre nos conseils sur les quantités d'entrée d'échantillon recommandées afin de vous assurer que les volumes de tampon sont appropriés et que les colonnes ne sont pas surchargées. Il s'agit d'une erreur courante qui peut rapidement réduire le rendement, la pureté et l'intégrité de votre ARN.

2.2 Après la lyse, effectuez la procédure à température ambiante

Après la lyse de l'échantillon, effectuez toutes les étapes à température ambiante. Cela empêchera le détergent de précipiter dans les tampons. Ne placez pas vos échantillons sur de la glace après lyse.

2.3 Tubes de collecte d'étiquettes

Avant d'appliquer votre échantillon à la colonne d'élimination de l'ADN génomique, assurez-vous d'étiqueter le tube de prélèvement, car vous jetterez la colonne après la centrifugation. Après avoir fait passer votre échantillon dans la colonne d'élimination de l'ADN génomique, assurez-vous d'avoir sauvegardé le flux. Ce flux contient votre ARN.

2.4 Ajouter un volume d'éthanol à votre flux continu

Si vous souhaitez capturer l'ARN total, y compris les petits ARN, ajoutez un volume d'éthanol à votre flux à partir de la colonne d'élimination de l'ADNg, en vue de sa liaison à la colonne de purification de l'ARN. Si vous souhaitez exclure les ARN inférieurs à deux cents nucléotides, n'ajoutez que la moitié du volume d'éthanol à votre flux à partir de la colonne d'élimination de l'ADNg.

2.5 Effectuez toutes les étapes de lavage et essorez pendant deux minutes après votre dernier lavage

Il est très important d'effectuer toutes les étapes de lavage du protocole afin de produire de l'ARN très pur. Assurez-vous de faire tourner votre colonne pendant deux minutes après le dernier lavage.

2.6 Pour les échantillons à faible rendement, éluer dans 50ul d'eau sans nucléase

Pour les échantillons à faible rendement, y compris les muscles ou le cerveau, ou pour les faibles apports de départ, envisagez d'éluer l'ARN avec 50 microlitres d'eau sans nucléase afin d'obtenir un ARN concentré. Il est important d'avoir une concentration supérieure à 20 nanogrammes par microlitre. Si un spectrophotomètre à microvolume, tel qu'un NanoDrop, sera utilisé pour mesurer la concentration et la pureté.

Partie 3 Après votre préparation

3.1 Spin pour enlever la silice

Dans certains cas, des particules de silice de la matrice de la colonne peuvent être trouvées dans votre éluat. Pour vous assurer que cela n'affecte pas votre rapport OD260-230, vous pouvez centrifuger l'éluat pendant une à deux minutes à 1600 x G et pipeter l'aliquote à partir du moment du liquide pour la mesure sur un spectrophotomètre.

3.2 Ajouter de l'EDTA pour protéger l'ARN et conserver en aliquotes

Bien que de l'eau sans noyau soit fournie dans ce kit pour l'élution de l'ARN, l'ajout d'EDTA à une concentration finale de 0,1 à 1 millimolaire peut protéger les échantillons d'ARN qui seront stockés pendant une période prolongée. De plus, il est recommandé de stocker l'ARN élué en aliquotes pour éviter des cycles de gel-dégel excessifs.


Progrès récents dans la technologie des vaccins à ARNm

Les vaccins à ARNm corrigent bon nombre des faiblesses des types de vaccins conventionnels.

Les innovations de ces dernières années ont révolutionné l'applicabilité des vaccins à ARNm.

Les vaccins à ARNm ont démontré un haut niveau d'efficacité dans les études précliniques.

Les essais cliniques humains de vaccins à ARNm sont fortement poursuivis.

Les vaccins à ARN messager (ARNm) représentent une classe de vaccins relativement nouvelle et très prometteuse pour l'avenir. Cet optimisme s'appuie sur des études récemment publiées démontrant l'efficacité des vaccins à ARNm dans la lutte contre plusieurs types de cancer et d'agents pathogènes infectieux où les plates-formes vaccinales conventionnelles peuvent ne pas induire de réponses immunitaires protectrices. Ces résultats n'auraient pas été possibles sans les récentes innovations critiques dans le domaine, telles que le développement de matériaux sûrs et efficaces pour in vivo Livraison d'ARNm et protocoles avancés pour la production d'ARNm de haute qualité. Cette revue résume les développements les plus importants dans les vaccins à ARNm au cours des dernières années et discute des défis et des orientations futures pour le domaine.


Résultats et discussion

Préparation et séquençage de la bibliothèque IVT-seq

Pour générer des bibliothèques IVT-seq (pour plus de détails, veuillez consulter le matériaux et méthodes section), nous avons produit des stocks de glycérol individuels abritant chacun un seul plasmide humain entièrement séquencé de la Mammalian Gene Collection (MGC) [17]. Ensuite, nous avons extrait l'ADN plasmidique et l'avons plaqué à 50 ng par puits dans des plaques de 384 puits. Nous avons mélangé le contenu de trois plaques de 384 puits contenant un total de 1 062 clones d'ADNc (Fichier supplémentaire 1), transformé ce mélange en bactéries et étalé les bactéries sous forme de colonies uniques. Après une incubation d'une nuit, nous avons gratté ces plaques, amplifié les bactéries pendant quelques heures en culture liquide et purifié les plasmides des bactéries en tant que pool (figure 1A). Ensuite, nous avons linéarisé les plasmides et utilisé la polymérase SP6 pour conduire in vitro transcription des séquences d'ADNc clonées (figure 1B). Après un traitement à la DNase I pour éliminer la matrice d'ADN et la purification de l'ARN, nous nous sommes retrouvés avec un pool de 1 062 ARN humains différents dérivés de plasmides entièrement séquencés.

Construction de librairies IVT-seq. (UNE) Préparation d'un pool de 1 062 plasmides d'ADNc humain. Les contenus de trois plaques de 384 puits contenant des plasmides MGC ont été regroupés. Le pool a été amplifié par transformation en Escherichia coli, et les clones résultants ont été purifiés et regroupés. (B) Génération de transcriptions IVT. Un pool de plasmides MGC a été linéarisé et utilisé comme matrice pour un in vitro réaction de transcription. Les enzymes et les nucléotides non incorporés ont été purifiés, laissant un pool de transcrits polyA. (C) Création de librairies IVT-seq. Les quantités listées d'ARN IVT ont été mélangées avec de l'ARN total de foie de souris pour créer six pools avec des quantités finales d'ARN de 1 ug. L'ARN ribosomique a été épuisé dans ces pools à l'aide du kit Ribo-Zero Gold. L'ARN IVT et l'ARN de souris sont maintenant présents dans des pools aux rapports indiqués, suite à l'épuisement de l'ARNr de l'ARN total de souris. Ces pools ont été utilisés pour générer des bibliothèques d'ARN-seq à l'aide du kit/protocole TruSeq d'Illumina. L'ensemble de ce processus a été effectué en double. Les bibliothèques répliquées ont été regroupées séparément et séquencées dans des voies HiSeq 2000 distinctes (deux voies au total). IVT, in vitro transcrit MGC, Mammalian Gene Collection.

Pour approximer ce qui se passe dans une réaction ARN-seq totale, nous avons soumis cet ARN IVT à l'épuisement de l'ARNr, puis préparé des bibliothèques à l'aide du protocole Illumina TruSeq (figure 1C, IVT uniquement). Pour tenir compte des effets possibles du transporteur, nous avons également mélangé l'ARN IVT avec diverses quantités d'ARN total de souris dérivé du foie. L'ajout de l'ARN de souris a donné à ces échantillons une plus grande diversité (transcriptions d'environ 10 000 gènes contre 1 062) et ressemblait davantage à un échantillon biologique réel. De plus, en ajoutant de l'ARN de fond d'une espèce différente (souris) que l'ARN IVT (humain), nous avons facilité la différenciation entre les transcrits IVT et les séquences de souris lors de l'analyse en aval. Étant donné que l'ARN IVT ne contenait pas de séquences d'ARNr alors que l'ARN de souris en contenait, la quantité d'ARN de souris serait significativement réduite par l'étape d'épuisement de l'ARNr. Pour tenir compte de cela, nous avons mélangé l'IVT et l'ARN de souris de telle sorte que, après l'épuisement de l'ARNr, nous aurions des pools finaux avec des ratios IVT:souris de 1:1, 1:2 et 1:10. Enfin, pour tenir compte des ARN de souris potentiellement mappés sur le génome humain de référence et nos séquences IVT, nous avons préparé un pool constitué d'ARN de souris seul. Nous avons regroupé les six bibliothèques résultantes et les avons séquencées à l'aide d'un Illumina HiSeq 2000. Nous avons effectué tout ce processus en double.

Cartographie et couverture des données IVT-seq

Après le séquençage et le démultiplexage, nous avons aligné toutes les données sur le génome humain de référence (hg19) à l'aide du RNA-seq Unified Mapper (RUM) [14]. Pour toutes les analyses, nous n'avons utilisé que les données des lectures mappées de manière unique sur la référence, à l'exclusion de tous les multi-mappers (données contenues dans les fichiers RUM_Unique et RUM_Unique.cov). Sur les 1 062 transcrits IVT originaux, nous avons trouvé 11 alignés sur plusieurs loci génomiques, tandis que 88 alignés sur des loci qui se chevauchent. Pour éviter tout effet de confusion dans nos analyses, nous avons filtré ces transcriptions de toutes les analyses, nous laissant avec 963 transcriptions IVT non chevauchantes et alignées de manière unique. Nous avons constaté une excellente corrélation dans les niveaux d'expression entre les réplicats (niveau de transcription R 2 entre les réplicats >0.95 Fichier supplémentaire 2 : Figure S1A). Deuxièmement, au moins 90 % des 963 transcrits IVT ont été exprimés avec des fragments par kilobase d'exon par million de lectures cartographiées (FPKM) valeurs ≥5 dans tous les ensembles de données IVT-seq, à l'exception de la souris uniquement (tableau 1). Dans les échantillons IVT uniquement, plus de 80 % des séquences IVT étaient exprimées au-dessus de 100 FPKM (Fichier supplémentaire 2 : Figure S1B). Parce que nous avons préparé les plasmides MGC et les transcrits IVT en tant que pools, il est probable que les transcrits IVT présentant une couverture faible ou nulle étaient initialement présents à de faibles concentrations de plasmides avant les étapes de transformation et d'IVT. En utilisant la technique IVT-seq, nous avons pu détecter spécifiquement la grande majorité des transcrits IVT humains avec une couverture élevée à la fois en l'absence et en présence de l'ARN de souris de fond.

Bien que nous voyions des lectures alignées sur les transcriptions IVT humaines dans les données de souris uniquement, ces transcriptions représentent collectivement environ 2 % des lectures (tableau 1). Ces transcriptions avec une couverture plus élevée sont probablement le résultat de lectures de souris alignées sur des séquences humaines très similaires. Nous avons exclu ces séquences de nos analyses.

Variation intra-transcript de la couverture ARN-seq des transcrits IVT

Considérons d'abord les données IVT uniquement. Étant donné que ces transcrits ont été générés à partir d'une réaction IVT utilisant des séquences d'ADNc, ces données ne sont pas affectées par l'épissage ou une autre régulation post-transcriptionnelle. Ainsi, la plupart des régions des transcriptions doivent être « exprimées » et présentes à des niveaux similaires. Les exceptions seraient les séquences répétitives qui correspondent à plusieurs emplacements du génome et peuvent être mal représentées, et les extrémités des ADNc, qui sont sujettes à un biais de fragmentation. Pour tenir compte de cela, nous avons créé un jeu de données simulé qui modélise le processus de fragmentation et ne s'écarte des données uniformes que par le caractère aléatoire induit par la fragmentation. Nous avons généré deux de ces ensembles de données à l'aide du Benchmarker for Evaluating the Effectiveness of RNA-Seq Software (BEERS) [14]. Le premier ensemble de données contenait tous les transcrits IVT exprimés à peu près au même niveau d'expression (environ 500 FPKM). Pour le second, nous avons utilisé les valeurs FPKM des échantillons IVT uniquement comme graines, créant un ensemble de données simulé avec des niveaux d'expression correspondant étroitement aux données réelles (Fichier supplémentaire 3 : Figure S2). Ces ensembles de données sont respectivement appelés simulés et simulés en quantité appariée (QM). Les données simulées fournissent un résultat idéal, tandis que les données QM nous permettent de contrôler les artefacts résultant du niveau d'expression (par exemple, les transcrits avec une expression inférieure peuvent montrer plus de variabilité). Ensuite, nous avons aligné les deux jeux de données simulés à l'aide de RUM, avec les mêmes paramètres que pour les données biologiques. Ainsi, les deux ensembles de données simulés servent également de contrôles pour tout artefact introduit par l'alignement (par exemple, une faible couverture dans les régions répétées). Pour plus de détails sur la création de données simulées, consultez le matériaux et méthodes section.

En utilisant les données IVT dérivées du transcrit BC015891 comme exemple représentatif, le tracé de couverture théorique idéal à partir des données simulées montre une couverture presque uniforme sur toute la longueur du transcrit, sans aucun des pics et vallées extrêmes caractéristiques des ensembles de données biologiques (Figure 2A) . Cependant, nos données observées ont montré un degré élevé de variabilité, avec des pics et des vallées au sein d'un exon (figure 2B). De plus, ces modèles étaient reproductibles dans nos réplicats (Fichier supplémentaire 4 : Figure S3). Nous avons vu de nombreux autres cas de changements extrêmes de couverture : plus de 50 % des transcriptions IVT ont montré des changements plus du double de la couverture intra-transcription attribuables à la préparation et au séquençage de la bibliothèque (tableau 2 et fichier supplémentaire 5 : figure S4). Par exemple, BC009037 a montré des baisses soudaines à des niveaux d'expression extrêmement faibles dans ses deux exons (figure 2C). Les deux ensembles de données simulés n'ont montré aucun de ces modèles, ce qui indique que cette variabilité de la couverture n'est pas le résultat d'artefacts d'alignement. De plus, l'absence de ce modèle dans les données simulées par QM indique que ces différences de variation de couverture n'étaient pas dues au bruit d'échantillonnage introduit par les transcriptions avec une couverture faible ou élevée. Dans le cas de BC016283, les pics et les creux de couverture ont conduit à des différences de plus de cinq fois dans les niveaux d'expression entre les exons (figure 2D). Encore une fois, ces modèles étaient reproductibles à travers les réplicats (Fichier supplémentaire 4 : Figure S3). La polymérase SP6 ne peut pas tomber puis se rattacher à un point ultérieur du transcrit, laissant une région non transcrite. Par conséquent, étant donné que ces modèles ont montré des creux suivis de pics, ils ne peuvent pas être le résultat d'artefacts de in vitro transcription. De plus, nous avons séquencé directement les produits IVT et constaté que la grande majorité était transcrite avec peu ou pas de biais. Prises ensemble, ces données suggèrent que ces modèles de couverture sont principalement le résultat de biais techniques introduits lors de la construction de la bibliothèque, plutôt que de la biologie. Ces résultats sont cohérents avec une étude précédente qui utilisait l'ARN IVT comme standard dans les expériences d'ARN-seq [16], suggérant que notre méthodologie IVT-seq est adaptée pour identifier la variabilité technique des données de séquençage.

Variations intra-transcript de la couverture RNA-seq. (UNE) Couverture RNA-seq simulée pour un transcrit IVT représentatif (BC015891). Le graphique de couverture ARN-seq (noir) est affiché en fonction du modèle de gène (vert), car il est mappé sur le génome de référence. Les blocs correspondent aux exons et les lignes indiquent les introns. Les chevrons dans les lignes introniques indiquent la direction de la transcription. Les nombres sur l'axe des y font référence à la profondeur de lecture de RNA-seq à une position de nucléotide donnée. (B) Le graphique de couverture ARN-seq réel pour BC015891 dans l'échantillon IVT uniquement. Diagrammes de couverture représentatifs pour les transcriptions IVT (C) BC009037 et (RÉ) BC016283 sont affichés selon les mêmes conventions utilisées ci-dessus. Toutes les transcriptions sont affichées dans la direction 5ʹ à 3ʹ.

Variation entre les échantillons de la couverture ARN-seq des transcrits IVT

En plus de cette variabilité au sein des transcrits, nous avons également trouvé de nombreuses régions de transcrits montrant une variabilité extrême de la couverture entre les échantillons (figure 3). Par exemple, le sixième exon de BC003355 variait énormément par rapport au reste du transcrit dans toutes les dilutions IVT:souris. Fait intéressant, le schéma global de variation par rapport au reste du transcrit à travers les dilutions a été maintenu entre les réplicats. Presque aucune lecture dans la carte de l'échantillon de souris uniquement sur ce transcrit, ce qui élimine la possibilité que cette variabilité soit due à un alignement incorrect de l'ARN de souris.

Variations inter-échantillons de la couverture ARN-seq. Graphiques de couverture ARN-seq dans tous les échantillons pour les exons 4 à 11 du transcrit IVT BC003355. Les rectangles noirs identifient l'exon six, qui montre une extrême variabilité de la couverture par rapport au reste du transcrit lorsqu'il est visualisé sur tous les échantillons. Le rapport ARN IVT sur ARN de souris est indiqué à gauche des graphiques de couverture de chaque échantillon. Les parcelles de couverture (rouge pour le premier réplicat bleu pour le deuxième réplicat) sont affichées en fonction du modèle de gène (noir), tel qu'il est mappé sur le génome de référence. Les blocs dans le modèle de gène correspondent aux exons et les lignes indiquent les introns. Les chevrons à l'intérieur des lignes introniques indiquaient la direction de la transcription. Les nombres sur les axes y font référence à la profondeur de lecture de RNA-seq à une position de nucléotide donnée.

Y compris BC003355, nous avons trouvé 86 régions de couverture élevée et imprévisible (hunc) réparties sur 65 transcriptions (Fichier supplémentaire 6). Par conséquent, plus de 6 % des 963 transcrits IVT contenaient des régions présentant des variations sauvages mais reproductibles de la couverture ARN-seq entre les échantillons. Lors de l'identification de ces régions hunc, nous avons utilisé un filtre en deux étapes pour éliminer les régions variables résultant des lectures de souris mappées sur des séquences humaines très similaires. Tout d'abord, nous avons éliminé toutes les régions hunc provenant de transcrits avec FPKM ≥5 dans l'un ou l'autre ensemble de données de souris uniquement. Ensuite, pour tenir compte du désalignement localisé des lectures de souris, nous avons filtré toutes les régions hunc avec une couverture moyenne ≥10 dans l'un ou l'autre ensemble de données de souris uniquement. Nous avons également supprimé ces régions hunc avec une couverture de souris uniquement ≥10 dans les 100 paires de bases (pb) flanquantes de chaque côté. Compte tenu des critères rigoureux que nous avons utilisés pour identifier ces régions de forte densité (voir matériaux et méthodes section pour plus de détails), il est probable qu'il s'agisse d'une sous-estimation. Pour aborder la possibilité que les ARN de souris puissent interagir avec des ARN humains homologues et interférer avec eux dans trans, nous avons testé les séquences entourant ces régions à l'aide de la suite MEME [18], mais nous n'avons trouvé aucun motif de séquence que ces régions ont en commun. De plus, la profondeur de couverture dans ces régions n'a pas suivi une relation linéaire avec l'augmentation de l'ARN de souris, ce qui suggère qu'il ne s'agit pas simplement d'une interaction directe avec l'ARN de fond. Il n'y a pas de cause claire pour ces régions hunc, d'autant plus que nous avons préparé tous les échantillons à partir du même pool d'ARN IVT et que la seule différence entre les échantillons était les rapports relatifs de l'ARN IVT à l'ARN du foie de souris. Nous avons également recherché des régions hunc divergentes entre les deux réplicats, mais n'en avons trouvé aucune. Si de telles régions existent, elles pourraient être identifiées et surmontées en créant des bibliothèques en double. Les régions hunc que nous avons identifiées ci-dessus avec des modèles d'expression maintenus entre les réplicats présentent un plus grand défi, car elles n'ont pas pu être identifiées et filtrées en créant des bibliothèques en double. Ceci est particulièrement problématique pour l'utilisation de valeurs d'expression au niveau de l'exon pour identifier des événements d'épissage alternatifs ou une expression différentielle. La variation intra-transcript et inter-échantillons que nous voyons dans nos données IVT-seq suggère que la génération de bibliothèques introduit de forts biais techniques, qui pourraient confondre les tentatives d'étude de la biologie sous-jacente.

Sources de variabilité dans la couverture RNA-seq

Il existe trois sources potentielles de biais technique dans la préparation des bibliothèques : la biologie moléculaire spécifique à l'ARN (fragmentation de l'ARN, transcription inverse), la méthode de sélection de l'ARN (depletion de l'ARNr, sélection polyA) et la biologie moléculaire spécifique au séquençage (ligature d'adaptateur, enrichissement de pont PCR). Pour identifier les biais introduits uniquement par la biologie moléculaire spécifique au séquençage, nous avons créé une bibliothèque d'ADN-seq à partir des mêmes plasmides MGC utilisés comme modèles pour les bibliothèques IVT-seq (Fichier supplémentaire 7 : Figure S5). Ce faisant, nous avons sauté les étapes spécifiques à la biologie moléculaire IVT ou ARN. Nous avons également préparé deux bibliothèques IVT-seq supplémentaires en utilisant la sélection polyA ou aucune sélection, au lieu de l'épuisement de l'ARNr. En comparant nos données de bibliothèque de plasmides et les données IVT-seq à l'aide de diverses méthodes de sélection, nous avons pu identifier quels modèles de couverture étaient le résultat de la biologie moléculaire spécifique à l'ARN, de la méthode de sélection de l'ARN ou d'un aspect commun du protocole de génération de bibliothèque.

Nous avons séquencé la bibliothèque de plasmides à l'aide d'un Illumina MiSeq et aligné les données résultantes sur le génome humain de référence en utilisant la même méthode que les bibliothèques IVT-seq. Dans ces données de plasmide, nous avons vu 924 des séquences de clones d'ADNc avec des valeurs FPKM 5, contre environ 870 dans les deux échantillons IVT uniquement (tableau 1). Cette petite baisse de couverture était probablement due au fait que l'ARN IVT passe par plus d'étapes de regroupement pendant la construction de la bibliothèque que les plasmides. De plus, les plasmides ne sont pas affectés par les efficacités de transcription et de transcription inverse. De plus, les données plasmidiques mappées sur les séquences d'ADNc avec une couverture moyenne normalisée de 42,08, ce qui se situe dans la plage de valeurs de couverture que nous voyons pour les échantillons IVT-seq. Nous avons séquencé les bibliothèques de sélection sans sélection et polyA sur un HiSeq 2500. Ces données montrent également des valeurs de couverture de clone d'ADNc similaires aux autres bibliothèques IVT-seq.

Les données de plasmide représentent «l'entrée» dans la réaction IVT et les données de non-sélection représentent la mesure la plus proche de sa sortie directe. En mesurant le rapport 3'/5' en profondeur de couverture pour chaque transcrit IVT, nous avons pu évaluer la processivité de la polymérase SP6. Dans une réaction parfaitement processive, ce rapport 3'/5' serait de 1, indiquant que la polymérase n'est pas tombée de la matrice d'ADNc et a conduit à la formation de produits tronqués. Les rapports médians 3′/5′ pour le plasmide et aucune donnée de sélection étaient de 1 et de 0,98, respectivement, indiquant que l'arrêt prématuré de la réaction IVT n'était pas un facteur dans nos analyses.

Effet de différentes méthodes de sélection d'ARN sur les modèles de couverture

Notre analyse est illustrée par un examen des graphiques de couverture pour BC003355 dans tous nos différents ensembles de données. Le degré élevé de variabilité que nous avons noté dans le tracé de couverture de ce gène à partir de nos données appauvries en ARNr était absent dans les données de non-sélection et de plasmide (figure 4A). Alors que les données polyA ont également montré moins de pics et de vallées que les données d'ARN-seq total appauvri en ARNr, elles ont été marquées par le biais 3′ bien documenté. Ces données suggèrent que l'étape d'épuisement de l'ARNr est probablement responsable d'une grande partie des biais de couverture observés.

Sources de biais dans la couverture RNA-seq. (UNE) Graphiques de couverture ARN-seq pour le transcrit IVT BC003355 à partir de données simulées (noir), plasmide (bleu), aucune sélection (vert), appauvri en ARNr (rouge) et polyA (orange). Le modèle de gène est affiché en noir, sous tous les graphiques de couverture. Les blocs correspondent aux exons et les lignes indiquent les introns. Les chevrons dans les lignes introniques indiquent la direction de la transcription. (B) Distributions des coefficients de variation entre les données affichées ci-dessus, avec l'ajout des données simulées par QM (gris). Notez que bien que le graphique soit coupé à un coefficient de variation de 1,3, les queues des distributions appauvries en ARNr et polyA s'étendent à 2,13 et 2,7, respectivement. (C) Tailles d'effet pour les différences de distribution des coefficients de variation entre les bibliothèques de séquençage et les données simulées. Les tailles d'effet sont calculées comme les ratios par transcription des coefficients de variation entre une bibliothèque donnée et l'ensemble de données simulé. QM, quantité correspondante.

Pour quantifier la variabilité pour chaque méthode de sélection, nous avons calculé le coefficient de variation au niveau de base unique de la couverture pour tous les transcrits IVT dans chacun de ces ensembles de données (figure 4B). En utilisant un test de somme de rang de Wilcoxon (plasmide n = 924, aucune sélection n = 870, ARNr appauvri n = 869), nous avons trouvé que les données appauvries en ARNr avaient une variabilité significativement plus élevée que les données sans sélection et plasmide (P <2.2e -16 ). De plus, les bibliothèques appauvries en ARNr et polyA étaient plus de 60 % plus variables en moyenne que la bibliothèque de plasmides (figure 4C). Cela suggère qu'une partie importante de la variabilité observée de la couverture entre les transcrits dans les données IVT-seq est le résultat de la biologie moléculaire spécifique à l'ARN, en particulier l'étape de sélection de l'ARN. De plus, après avoir pris en compte le biais introduit par les séquences elles-mêmes (données plasmidiques) et le biais introduit par la réaction IVT (pas de données de sélection), nous avons constaté que 50 % des transcrits présentaient une variation de deux fois et 10 % de la variation intra- expression du transcrit (tableau 2 et fichier supplémentaire 5 : figure S4). Bien qu'il soit bien apprécié que la sélection polyA introduit un biais, nous avons constaté que les données appauvries en ARNr introduisaient autant sinon plus. Aucun des deux ensembles de données simulés n'a montré de transcriptions avec un changement double ou supérieur dans l'expression intra-transcription. Encore une fois, cela suggère que les variations observées au sein de la transcription ne sont pas le résultat d'artefacts d'alignement ou d'échantillonnage dus à une expression faible ou élevée. Une source de biais communément reconnue provient de l'amorçage aléatoire lors de la préparation de la bibliothèque [10]. Lorsque nous avons examiné les différentes bibliothèques, nous avons constaté que des fragments de toutes les données RNA-seq présentaient des fréquences de nucléotides caractéristiques d'un biais d'amorçage aléatoire (Fichier supplémentaire 8 : Figure S6). Comme prévu, les données du plasmide n'ont montré aucun biais de ce type, car elles étaient dérivées directement de l'ADN et ne nécessitaient pas d'étape de génération d'ADNc. Cependant, les différences significatives entre toutes les bibliothèques d'ARN suggèrent que le biais de l'amorçage aléatoire n'est pas le seul facteur. Le plasmide et aucune donnée de sélection ne contiennent toujours une bonne quantité de variabilité lorsqu'ils sont visualisés à côté des données simulées (figure 4A noire). Lorsque nous avons examiné l'ensemble de données dans son intégralité, les données relatives au plasmide et à l'absence de sélection présentaient une variation significativement plus élevée que l'un ou l'autre des ensembles de données simulés (données simulées par le test de somme des rangs de Wilcoxon n = 963, données simulées par QM n = 869, plasmide n = 924, aucune sélection n = 870 P <2.2e -16 ). Ces données suggèrent que la biologie moléculaire spécifique au séquençage commune à toutes les bibliothèques que nous avons préparées (ligature d'adaptateur, amplification de bibliothèque par PCR) est également responsable d'une partie de la variabilité de la couverture observée et du biais de séquençage.

Les biais associés aux caractéristiques des séquences dépendent de la méthode de sélection de l'ARN

Compte tenu de ces différences significatives dans la variabilité de la couverture, nous avons cherché à identifier les caractéristiques de séquence qui pourraient contribuer à ce biais. Nous avons considéré trois caractéristiques de séquence quantifiables : l'entropie de l'hexamère, la teneur en GC et la similarité de séquence avec l'ARNr (voir matériaux et méthodes pour une description détaillée de ces métriques). Pour chaque stratégie de séquençage (plasmide, aucune sélection, ARNr appauvri, polyA), nous avons testé si l'une des trois caractéristiques de séquence avait un effet significatif sur la variabilité de la couverture de séquençage, telle que mesurée par le coefficient de variation. Alors que nous nous concentrons principalement sur la variabilité de la couverture en tant qu'indicateur de biais de séquençage, nous avons également examiné la profondeur de la couverture, telle que mesurée par le FPKM.

Pour chaque stratégie de séquençage, nous avons trié les transcrits par variabilité de couverture ou profondeur. Ensuite, nous avons sélectionné les 100 transcriptions les plus extrêmes et les 100 moins extrêmes de chaque liste. Nous avons comparé les valeurs des caractéristiques de séquence entre les 100 transcrits les plus extrêmes et les 100 moins extrêmes à l'aide d'un test de Wilcoxon. Important P- les valeurs indiquent une association significative de la caractéristique de séquence avec la variabilité de la couverture et/ou la profondeur. Les résultats de notre analyse sont affichés sous forme de boîtes à moustaches (Figure 5 et Fichier supplémentaire 9 : Figure S7).

Effets des caractéristiques des séquences sur la variabilité de la couverture. Distributions de (UNE) entropie de l'hexamère, (B) contenu GC, et (C) Similitude de séquence d'ARNr pour les 100 transcrits avec les coefficients de variation les plus élevés et les plus faibles pour la couverture des transcrits à partir du plasmide, aucune sélection, bibliothèques appauvries en ARNr et polyA. Les astérisques indiquent la signification d'un test de rang signé de Wilcoxon comparant les valeurs des caractéristiques de séquence répertoriées entre chaque paire de groupes du même échantillon. *P <0.05 **P <0.01 ***P <0.001.

Pour vérifier tout effet de confusion entre la profondeur de couverture et la variabilité, nous avons testé les transcriptions les moins et les plus exprimées pour toute corrélation avec la variabilité de la couverture (Fichier supplémentaire 10 : Figure S8). La bibliothèque polyA a montré une corrélation significative (P <2.2e -16 ) entre la variabilité de la couverture et la profondeur, ce qui indique que les caractéristiques de séquence pourraient affecter la couverture par la variabilité (ou vice versa). Les données appauvries en ARNr ont montré une légère corrélation significative (P = 0,04933). Il est possible qu'une caractéristique de la sélection d'ARN affecte à la fois la variabilité et la couverture, étant donné que nous n'avons vu aucune corrélation significative pour les deux échantillons restants. Cela indique que la variabilité de la couverture et la profondeur sont indépendantes pour le plasmide et aucune donnée de sélection.

Les trois caractéristiques de séquence avaient une association significative avec la variabilité et la profondeur de couverture dans au moins une des stratégies de séquençage. En particulier, une entropie plus faible de l'hexamère, une mesure de la complexité de la séquence [19-21], était fortement associée à une variance plus élevée dans toutes les bibliothèques d'ARN (pas de sélection P = 4,712e -05 épuisement de l'ARNr P = 3,956e -11 polyA P = 0,003921 Figure 5A). Cela suggère que le biais associé à l'entropie de l'hexamère est dû en partie à des procédures spécifiques à l'ARN dans la préparation de la bibliothèque. De plus, une association avec une entropie hexamère inférieure indique qu'il y a plus de séquences répétées dans les transcrits avec une variabilité plus élevée. Cela pourrait indiquer des structures secondaires d'ARN complexes, car des motifs répétés pourraient faciliter la formation en épingle à cheveux. De plus, l'absence de cette association dans les données plasmidiques suggère que cette observation n'était pas due à des artefacts de cartographie. Les données plasmidiques contenaient les mêmes séquences que les données RNA-seq et seraient sujettes aux mêmes biais introduits par notre exclusion des lectures multi-mappées.

Une teneur en GC plus élevée était fortement associée à une variabilité de couverture plus faible dans les données sans sélection et polyA (P = 5.627e -13 P = 4,914e -05 Figure 5B), suggérant que les effets du biais GC sur la variabilité intra-transcript pourraient survenir, en partie, en raison de certains aspects spécifiques à l'ARN de la préparation de la bibliothèque. En outre, il semble que le biais GC n'était pas un facteur contribuant de manière significative à la profondeur de la couverture ou à l'extrême variabilité des données appauvries en ARNr. Pendant ce temps, une teneur en GC plus faible était associée à une couverture plus élevée dans les données plasmidiques (P = 3,776e -05 ), et une profondeur de couverture inférieure dans les bibliothèques sans sélection et polyA (pas de sélection P = 8.531e -05 polyA P = 0,0009675 Fichier supplémentaire 9 : Figure S7B). Étant donné que cette tendance a changé de direction entre la bibliothèque de plasmides et les bibliothèques d'ARN, cela suggère également qu'un aspect spécifique à l'ARN de la préparation de la bibliothèque introduit un biais GC distinct du biais GC élevé associé au séquençage d'Illumina [22].

Fait intéressant, une plus grande similarité de séquence d'ARNr était associée à une plus grande variabilité de couverture dans la bibliothèque appauvrie en ARNr (P = 9.006e -05 ) et une variabilité plus faible dans la bibliothèque sans sélection (P = 0,0367 figure 5C). Il n'est pas surprenant que la similitude avec les séquences d'ARNr ait contribué à la variabilité des données appauvries en ARNr, étant donné que l'appauvrissement en ARNr est basé sur la liaison par paire entre les sondes et les séquences d'ARNr. Bien qu'il ne soit pas clair pourquoi cette tendance s'est inversée dans la bibliothèque sans sélection, elle est frappante étant donné l'augmentation significative de la variabilité intra-transcription entre les bibliothèques sans sélection et appauvries en ARNr (figure 4B). De plus, nous avons observé une corrélation légère mais hautement significative (Pearson R 2 = 0,308452 P <2.2e -16) entre la similarité d'une séquence de transcription avec l'ARNr et l'ampleur de la différence de couverture entre les bibliothèques sans sélection et appauvries en ARNr (Fichier supplémentaire 11 : Figure S9 et fichier supplémentaire 12). Bien que la majorité des facteurs contribuant au biais extrême dans la couverture des séquences que nous avons vu dans les données appauvries en ARNr restent flous, nos données suggèrent que cela pourrait être en partie dû à l'épuisement des séquences homologues à l'ARNr.

Ensemble, nos données démontrent l'utilité et le potentiel de la méthode IVT-seq pour identifier les sources de biais techniques introduites par les plateformes de séquençage et les protocoles de préparation de bibliothèques.


Stratégies d'administration simultanée et successive d'ARN

Les expériences avancées d'administration de gènes non viraux nécessitent souvent l'administration conjointe de plusieurs acides nucléiques. Par conséquent, la disponibilité de méthodes de co-transfection fiables et robustes et de critères de sélection définis pour leur utilisation, par exemple, l'expression de protéines multimères ou la livraison mixte ARN/ADN est de la plus haute importance. Ici, nous avons étudié différentes approches de co-transfection et successives, avec un accent particulier sur l'ARN messager transcrit in vitro (IVT-ARNm). Les niveaux d'expression et les modèles de deux rapporteurs de protéines fluorescentes ont été déterminés, en utilisant différentes doses d'ARNm-IVT, des porteurs et des types cellulaires. Les paramètres quantitatifs déterminant l'efficacité de la co-administration ont été analysés pour les IVT-ARNm prémélangés avant la formation de nanocarriers (co-transfection intégrée) et lors de la transfection simultanée de cellules avec des nanocarriers formés séparément (co-transfection parallèle), ce qui a entraîné un niveau d'expression beaucoup plus élevé. hétérogénéité pour les deux journalistes. La livraison successive d'ARNm a révélé une efficacité de transfection inférieure dans le deuxième tour de transfection. Toutes ces différences se sont avérées plus prononcées pour de faibles doses d'ARNm. La livraison simultanée d'ARNsi avec l'ARNm a également indiqué l'efficacité de co-transfection la plus élevée pour la méthode intégrée. Cependant, l'efficacité maximale a été montrée pour les livraisons successives, en raison du pic de sortie cinétiquement différent pour les deux entités opérant discrètement. Nos résultats fournissent des orientations pour la sélection de la méthode de co-administration la mieux adaptée pour répondre aux exigences expérimentales, en soulignant en particulier la dépendance dose-réponse d'acide nucléique vis-à-vis de la co-administration au niveau de la cellule unique.

Mots clés: Co-expression ARNm synthétisé in vitro Co-transfection intégrée Co-transfection parallèle Transfection successive Méthodes de transfection.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts concurrents.

Les figures

Aperçu schématique des différentes transfections…

Présentation schématique des différentes méthodes de transfection : co-transfection intégrée une fait référence au mélange de différents…

Plan d'expériences et description…

Conception d'expériences et description des conditions de transfection pour la co-livraison d'IVT-ARNm et…

Transfection simultanée de macrophages avec…

Transfection simultanée de macrophages avec EGFP et mCherry codant IVT-ARNm avec deux différents…

Comparaison de la co-administration IVT-ARNm en utilisant…

Comparaison de la co-administration IVT-ARNm à l'aide de transporteurs liposomaux et polymères dans des cellules HeLa. Fluorescent…

Comparaison des systèmes intégrés et parallèles…

Comparaison des approches de co-transfection intégrées et parallèles pour la livraison d'ADNp dans les cellules HeLa…

Transfection successive d'IVT-ARNm dans…

Transfection successive d'IVT-ARNm dans des cellules HeLa avec des images fluorescentes LipoMM représentées comme…

Co-livraison versus livraison successive de…

Co-administration versus administration successive de siRNA et IVT-mRNA dans des cellules d2EGFP HeLa transfectées…


In vitro Livraison d'ARNm transcrit à l'aide de nanoparticules PLGA/PEI dans des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains

Induction de la synthèse des protéines par la livraison externe de in vitro L'ARN messager de transcription (IVT-ARNm) a été une approche utile dans le domaine de la biologie cellulaire, du traitement des maladies, de la reprogrammation des cellules et de la conception de vaccins. Par conséquent, le développement de nouvelles formulations pour la protection de l'ARNm contre les nucléases est nécessaire pour maintenir son activité in vivo. Le but de la présente étude était d'étudier l'absorption, la toxicité, l'efficacité de la transfection ainsi que les conséquences phénotypiques d'une nanoparticule (NP) en culture cellulaire. NP se compose de poly D, L-lactide-co-glycolide (PLGA) et polyéthylèneimine (PEI) pour la livraison de in vitro L'ARN messager de transcription (IVT-ARNm) a codé la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains (moDC). Les nanoparticules synthétisées et encapsulées avec de l'ARNm synthétique de la GFP présentaient une distribution de taille dans cette formulation, avec des tailles de particules moyennes comprises entre 415 et 615 nm. Le potentiel zêta était positif (au-dessus de 12-13 mV) et l'efficacité d'encapsulation dépassait 73,5%. Nos résultats ont démontré que l'encapsulation de l'ARNm de la GFP par les NP PLGA/PEI n'avait aucun effet toxique sur les cellules dendritiques immatures dérivées de monocytes et était capable de délivrer de l'ARNm IVT dans les moDC et était très efficace. L'expression de la protéine GFP 48 h après la transfection a été confirmée par cytométrie en flux, examen microscopique et test de western blot. Ce NP peut permettre de cibler les moDCs pour exprimer une variété d'antigènes par IVT-ARNm. La présente étude a introduit le PLGA/PEI NP, qui a fourni une livraison efficace de l'ARNm IVT qui code pour la protéine GFP.

Mots clés: Cellules dendritiques GFP IVT- ARNm Nanoparticule PEI PLGA.

Les figures

Diagramme schématique démontrant la préparation et…

Diagramme schématique démontrant la préparation et la synthèse de poly (D, L…

(A) Le plasmide pGE-GFP contenant…

(A) Le plasmide pGE-GFP contenant GFP gène et structures flanquantes agissant en cis telles que…

Caractérisation de nanoparticule PLGA/PEI. Balayage…

Caractérisation de nanoparticule PLGA/PEI. Images au microscope électronique à balayage (MEB) montrant la morphologie sphérique…

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Ne pas trop sécher l'ADNc ou les nucléotides

Ce qui suit est une liste de techniques de laboratoire courantes qui sont importantes pour le succès de toute procédure, mais qui se sont avérées particulièrement importantes dans un protocole à plusieurs étapes comme l'amplification d'ARN. Même si le temps est limité, ne lésinez pas sur ces techniques de base.

Faire des master mix
Les mélanges maîtres doivent être préparés lors du traitement de 2 échantillons ou plus simultanément afin de réduire le nombre d'étapes de pipetage et le risque d'erreur de pipetage. Toujours inclure

5 % de surconsommation de tous les réactifs dans les mélanges maîtres pour couvrir les erreurs de pipetage.

Décongeler correctement tous les réactifs
Tous les réactifs congelés doivent être complètement décongelés, soigneusement mélangés, centrifugés brièvement et placés sur de la glace si nécessaire. Cependant, laissez les composants IVT s'équilibrer à température ambiante avant de configurer vos réactions car la spermidine dans le tampon de réaction peut provoquer la précipitation de l'ADNc à des températures plus basses. Pour garantir des performances optimales, décongelez les composants à température ambiante et évitez les températures plus élevées.

Soyez doux avec les enzymes
Ne jamais vortexer les enzymes. Mélanger en tapotant doucement le côté du tube pour éviter d'inactiver l'enzyme.

Le succès de votre analyse de puces à ADN dépend de la qualité de l'ARNa utilisé dans l'hybridation. Le fait de suivre ces conseils et rappels pour l'amplification peut augmenter considérablement la probabilité d'obtenir des données d'ARNa de bonne qualité et des microarrays reproductibles.


4 Marquage post-synthétique et post-transcriptionnel des ARN

Outre l'introduction de nucléotides modifiés pendant la phase solide ou la synthèse enzymatique, l'ARN naturel peut également être marqué de manière post-synthétique ou post-transcriptionnelle.À ce jour, une variété d'approches différentes a été rapportée utilisant des modifications chimiques 122-128 ou des désoxyribozymes catalytiquement actifs, 129-132 ribozymes 133-135 et des enzymes 136-140 pour accomplir des réactions de modification sur l'ARN non modifié. A partir de séquences d'ARN préexistantes, qui peuvent soit être préparées in vitro, par des stratégies synthétiques ou enzymatiques ou émergent d'origine endogène, les oligonucléotides d'ARN subissent des réactions de marquage introduisant des groupes rapporteurs fonctionnels tels que des fluorophores, des marqueurs d'affinité ou des poignées de petites molécules pour une modification ultérieure avec des groupes rapporteurs. 14 En principe, les approches de marquage d'ARN post-synthétique et post-transcriptionnel peuvent être appliquées aux séquences courtes et longues de la même manière et ne sont pas confrontées à des limitations concernant les ARN longs. Cependant, une attention particulière doit être accordée à la spécificité du site et à l'universalité de telles approches en ce qui concerne l'applicabilité à tous les types d'ARN et pas seulement à ceux présentant des caractéristiques distinctives intrinsèques. 14 Comme mentionné précédemment, un large éventail de techniques de marquage pour l'ARN non modifié a été développé à ce jour. Certes, certaines techniques incluent des méthyltransférases pour l'introduction de modifications au niveau de la structure 5'-cap 141 ou au niveau de l'extrémité 3'-terminale 142 ou de la queue poly(A). 143 D'autres approches utilisant des ribozymes auto-alkylants, 144 ARNt-guanine transglycosylases (ARN-TAG) 145 ou ARNt Ile2 -agmatidine synthétase (Tias) 146 sont basées sur des éléments structurels plus grands qui doivent être fusionnés à l'ARN d'intérêt. Comme cette revue se concentre sur le marquage interne covalent et spécifique au site de l'ARN long avec un impact minimal sur le repliement et la fonction natifs de l'ARN, les approches susmentionnées ne seront pas décrites dans la section suivante.

4.1 Stratégies chimiques pour le marquage spécifique au site de l'ARN non modifié

Dans les oligonucléotides d'ARN non modifiés, une pléthore de sites de fonctionnalisation sont disponibles car le résidu 2'-OH du sucre ribose possède un caractère nucléophile et offre donc de multiples options pour les modifications chimiques. 147, 148 Des précautions particulières doivent être prises pour tenir compte de la spécificité de site et de la chimiosélectivité afin de sélectionner uniquement un certain site cible de l'oligonucléotide d'ARN. 148 Ceci peut être réalisé grâce à l'utilisation de brins auxiliaires d'ADN assignés pour guider un groupe fonctionnel vers le site de modification souhaité et pour protéger l'ARN restant des réactifs chimiques. 123, 124, 127, 128

4.1.1 Marquage chimique à base d'ADN via la formation de jonctions à quatre voies

En appliquant une stratégie de marquage chimique basée sur l'ADN, Jahn et al. ont démontré l'introduction spécifique au site d'un groupe thiol pour la fixation ultérieure de marqueurs pour l'ARN synthétique et endogène. 124 La fonctionnalisation thiol peut être attachée à des nucléotides internes prédéterminés de l'ARN accepteur par formation d'une jonction à quatre voies avec un ADN donneur lié à un groupe acide carboxylique activé et à deux brins de guidage d'ADN spécifiques au site. Le brin donneur d'ADN sera ensuite couplé à un groupe 2'-OH interne spécifique de l'ARN accepteur via le groupe acide carboxylique activé. Par la suite, la liaison disulfure adjacente dans le lieur du donneur est clivée, produisant finalement l'ARN accepteur modifié par un thiol. Ensuite, l'ARN cible modifié par un thiol spécifique au site peut en outre être marqué avec un groupe rapporteur qui a été démontré par couplage d'un fluorophore fonctionnalisé par maléimide. 124

4.1.2 Marquage chimique sur modèle d'ADN via la formation de duplex

Une stratégie alternative de marquage chimique a été développée par Freisinger et ses collaborateurs en utilisant une approche basée sur un modèle d'ADN pour la génération spécifique de séquence d'éthéno-adduits dans l'ADN simple brin. 122 Ainsi, un ADN de guidage portant un agent d'alkylation s'hybride à l'ADN cible pour rapprocher la base cible et l'agent d'alkylation. En utilisant cette approche, le groupe de Freisinger n'a obtenu que des rendements modérés allant jusqu'à 30 %. 122 En améliorant les rendements jusqu'à 65 %, Sigel, Freisinger et leurs collègues ont démontré la formation sur un modèle d'ADN d'un ADN 16-mère simple brin modifié au 12-propargyl-éthéno-adénine et son équivalent ARN et le marquage ultérieur par fluorophore via CuAAC. 123 Cette méthode a permis en principe l'incorporation de groupes bioorthogonaux dans des régions simple brin d'ADN et d'ARN de longueur illimitée. Le marquage fluorescent d'un grand oligonucléotide d'ARN a été établi pour la construction de ribozyme d'intron du groupe II D135-L14 de 633 nt de long dérivée de la Saccharomyces cerevisiae Sc.ai5γ. 123 En 2018, ils ont également présenté un étiquetage bicolore spécifique au site de la longueur réglementaire de 275 nt btuB riboswitch de Escherichia coli (E. coli) en combinant une fonctionnalisation interne avec une ouverture oxydative du ribose 3'-terminal et une conjugaison ultérieure à deux fluorophores différents. 128 Pliage natif et fonction du btuB Les ARN riboswitch ont été étudiés à l'aide de smFRET pour caractériser l'équilibre conformationnel de la btuB riboswitch lors de la liaison de son cofacteur adénosylcobalamine. L'expérience a prouvé que non seulement les nucléotides dans les régions simple brin mais aussi dans les ARN avec des structures secondaires complexes peuvent être ciblés. 128

4.1.3 Acylation de l'ARN au niveau des boucles induites

Plus récemment, Kool et ses collaborateurs ont développé la technique d'acylation de l'ARN au niveau des boucles induites (RAIL) pour in vitro fonctionnalisation de l'ARN au niveau de groupes 2'-OH spécifiques au sein de la séquence. 127 RAIL utilise des brins d'ADN auxiliaires complémentaires pour exposer des boucles ou des lacunes aux sites prédéfinis souhaités dans l'ARN d'intérêt afin de permettre l'acylation 2′-OH sélective avec un réactif d'acylimidazole, par ex. g. azoture de nicotinyl acylimidazole (NAI-N3, figure 7). Les segments d'ARN restants et leurs groupes 2'-OH réactifs sont protégés par les structures duplex ADN-ARN formées. Après la réaction d'acylation, l'ADN auxiliaire peut être dégradé par digestion par la DNase. 126 En utilisant cette stratégie, l'adduit mono-acylé souhaité s'est formé de manière prédominante et seule une fraction mineure de produit secondaire acylé au niveau du nucléotide adjacent 5' au renflement induit a été observée. 127 L'adressage des sites d'acylation à proximité immédiate des extrémités 5' et 3' de l'ARN a révélé un manque de sélectivité pour l'approche d'induction d'espace en tant qu'hybridation fiable d'un court brin d'ADN auxiliaire complémentaire du 5'- ou 3' -la fin de l'ARN ne peut pas être assurée. 127 RAIL a été utilisé pour contrôler sélectivement l'activité catalytique d'un ribozyme de tête de marteau en tandem de 81 nt (TR) avec des noyaux catalytiques doubles (3TR et 5TR). L'acylation spécifique au noyau 3TR guidée vers le site cible via un espace induit, a ensuite supprimé le taux de clivage de 5 fois et conservé 85 % du taux initial de TR non traité avec le substrat 5TR. 127 En comparaison, l'acylation spécifique au site du noyau 5TR facilitée par une stratégie de boucle induite a supprimé le taux de clivage d'un facteur 4 et conservé 93 % du taux initial de TR non traité avec le substrat 3TR. Ainsi, cette méthode fournit un contrôle local de l'acylation de l'ARN dans l'ARN multifonctionnel et des rendements élevés de suppression basée sur l'acylation de la fonction de l'ARN local avec peu d'acylation hors cible. 127 En outre, le groupe de Kool a testé le double marquage d'un petit ARN nucléolaire SNORD78 de 65 nt pour des expériences de FRET via un marquage RAIL en série. 127 Le marquage successif a été réalisé par acylation induite par la première boucle avec NAI-N3 à G14 et une réaction SPAAC subséquente avec Alexa488-azide, suivie d'une deuxième étape d'acylation à A49 et d'une réaction de clic subséquente avec de la tétraméthylrhodamine (TAMRA)-azide. 127 Dans l'ensemble, la méthode RAIL est bien adaptée à l'acylation interne dirigée vers le site et à la fonctionnalisation supplémentaire, en particulier pour les ARN plus longs. Les ARN avec plusieurs centaines de nucléotides de long pourraient en principe être acylés sélectivement, si les ADN auxiliaires sont préparés par voie enzymatique ou si plusieurs ADN auxiliaires synthétiques sont disposés le long de l'ARN d'intérêt. 127 Le principal inconvénient de cette approche est la formation de 20 à 30 % de produits d'acylation secondaires adjacents à la position ciblée. 127 Fait intéressant, le réactif d'acylation NAI-N3 qui a jusqu'à présent été utilisé pour la conjugaison par clic ainsi que pour le blocage et la mise en cage 125 forme un adduit réversible sur l'ARN qui peut être éliminé par désacylation bioorthogonale avec des phosphines. 127

Marquage d'ARN sélectif par site via l'acylation d'ARN à des structures en boucle induite (RAIL). 127 Un brin d'ADN auxiliaire complémentaire est hybridé en exposant une boucle à un site prédéfini dans l'ARN endogène d'intérêt pour permettre une acylation 2′-OH sélective avec un réactif d'acylimidazole (ici : azoture de nicotinyl acylimidazole). Les segments d'ARN restants et leurs groupes 2'-OH sont protégés par le duplex ADN-ARN auxiliaire. Après acylation, le brin d'ADN auxiliaire est dégradé par traitement à la DNase. L'ARN acylé de manière sélective peut être encore modifié par des réactions CuAAC avec des conjugués alkine fonctionnalisés.

4.2 Désoxyribozymes pour le marquage d'oligonucléotides d'ARN non modifiés

Les DNAzymes peuvent non seulement être utilisées pour ligaturer l'ARN comme décrit dans la section 2.2, mais peuvent également être utilisées pour le marquage post-transcriptionnel ou post-synthétique de l'ARN. 129-132 À cette fin, il existe des désoxyribozymes spéciaux qui peuvent soit lier un brin d'ARN modifié ou un seul nucléotide à un ARN préexistant. 129, 149 Un avantage majeur de cette approche est la spécificité de marquage élevée facilitée par des interactions d'appariement de bases spécialement conçues entre l'ARN cible et DNAzyme. 129, 149 Par rapport à l'ARN, la préparation facile et peu coûteuse du désoxyribozyme par synthèse standard d'ADN en phase solide et la grande stabilité de l'ADN permettent en principe une large application dans les laboratoires biochimiques.

4.2.1 Marquage catalysé par désoxyribozyme introduisant des ramifications phosphodiester

En introduisant l'approche du marquage catalysé par le désoxyribozyme (DECAL), Silverman et ses collègues ont utilisé efficacement le 10-DM24 DNAzyme pour modifier l'ARN à des positions internes spécifiques (figure 8). 129 Par conséquent, un ARN de marquage est créé par in vitro transcription introduisant une cytidine modifiée en 5-aminoallyle à sa deuxième position. Le groupe amino primaire sur l'aminoallyl-ARN est ensuite fonctionnalisé par réaction avec un dérivé ester de NHS pour obtenir un ARN de marquage marqué. En utilisant le DNAzyme 10-DM24 qui s'hybride à la fois à l'ARN cible et à l'ARN de marquage, l'ARN de marquage marqué est attaché à un groupe 2′-OH interne de l'ARN cible pour entraîner une formation de liaison 2′,5′-phosphodiester produisant un oligonucléotide ramifié. Le marqueur peut être attaché à différents sites au sein de l'ARN cible par modification respective des bras de liaison de l'ADNzyme. 129 Par cela, Silverman a signalé l'application réussie de DECAL pour installer deux fluorophores sur des sites internes spécifiques des 160 nt de long P4-P6 Tétrahymène ARN P4–P6 de l'intron du groupe I permettant d'étudier le repliement de l'ARN dépendant de Mg 2+ par FRET. 129

Marquage catalysé par désoxyribozyme raffiné (DECAL) d'ARN préexistant avec l'ADNzyme 10-DM24 appliquant des ions de métaux lourds auxiliaires et le dérivé GTP modifié au phosphorothioate Sp-GTP S . 130, 131 Le désoxyribozyme 10-DM24 modifié catalyse la fixation de mononucléotides de guanine modifiés à un groupe 2'-OH dans le brin d'ARN d'intérêt. Ajout du cofacteur oligonucléotidique R?? compense un substrat oligonucléotidique autrefois plus long et est nécessaire pour une conversion suffisante. Les bras de liaison du désoxyribozyme s'hybrident à l'ARN cible et peuvent être adaptés pour des sites cibles individuels afin de permettre une modification de l'ARN spécifique au site. Phosphorothioate-modifié Sp-GTP S est utilisé comme substrat de ligature pour empêcher l'hydrolyse ultérieure de la phosphodiestérase de la modification de la branche 2′,5′ catalysée par 10-DM24 en raison de la configuration stérique particulière de la liaison nouvellement formée en 2′-Rp-ARN marqué au PS. Tb 3+ agit comme un cofacteur accélérateur qui permet des conversions efficaces à pH 7,5 et réduit la concentration requise de triphosphate GTP modifié. Les ions Cd 2+ thiophiles sont utilisés pour empêcher les effets d'interférence du phosphorothioate sur la coordination des ions métalliques par le complexe ternaire 10-DM24/ARN/GTP S.

Sur la base de l'approche susmentionnée, Höbartner et Silverman ont rapporté une ingénierie supplémentaire du désoxyribozyme 10-DM24 pour accepter des mononucléotides comme substrats de ligature au lieu d'oligonucléotides 5'-triphosphorylés. 149 La ligature catalysée de mononucléotides GTP libres par l'ADNzyme 10-DM24 modifié nécessite l'ajout auxiliaire d'un cofacteur oligonucléotidique pour stabiliser la structure secondaire et tertiaire du désoxyribozyme. 149

De plus, Höbartner et ses collaborateurs ont montré que les cofacteurs de lanthanide, en particulier le Terbium (Tb 3+ ), sont capables d'accélérer la synthèse catalysée par l'ADN d'ARN ramifié. 132 Ils ont présenté une approche générale de marquage post-transcriptionnel pour l'ARN endogène avec différents triphosphates de guanine modifiés par ribose et Tb 3+ comme cofacteur accélérateur pour installer des groupes fonctionnels tels que les azotures et les amines primaires, les réactifs d'affinité, les fluorophores, les marqueurs de spin et les agents de réticulation. à 2'-OH groupes d'adénines internes dans in vitro ARN transcrit (figure 8). 130 Cette méthode offre plusieurs avantages : tout d'abord, l'utilisation de mononucléotides modifiés disponibles dans le commerce garantit une petite taille de modification par rapport aux oligonucléotides de marquage utilisés précédemment et en même temps réduit le travail préparatoire. 130 Deuxièmement, l'utilisation de Tb 3+ comme cofacteur accélérateur de l'ADNzyme permet des conversions efficaces à pH physiologique et réduit la concentration de dérivés de GTP requise pour le marquage. Des rendements globaux > 80 % ont pu être obtenus pour la plupart des analogues de GTP marqués, fournissant en même temps des vitesses de réaction rapides de kobs1 min -1 . 130 Le groupe de Höbartner a utilisé cette méthode pour introduire deux fluorophores sous forme de paire FRET sur l'ARN riboswitch SAM II par deux réactions de marquage catalysées par DNAzyme successives pour étudier le repliement induit par Mg 2+ de son domaine aptamère long de 52 nt en présence et en l'absence de SAM ligand. 130 Les résultats observés étaient cohérents avec les données précédemment rapportées, 150 prouvant la pleine fonctionnalité du riboswitch marqué. 130 En outre, ils ont prouvé l'applicabilité de leur approche pour marquer des transcrits d'ARN plus gros in vitro. Pour le snRNA spliceosomal U6 de 120 nt de long, dix positions de marquage différentes pour le méthylanthraniloyl-G (MANT-G) ont été testées en révélant l'influence totale de la structure secondaire sur la liaison efficace du désoxyribozyme et la catalyse. 130 Pour améliorer le marquage catalysé par l'ADN des ARN repliés de manière complexe, l'utilisation d'oligonucléotides perturbateurs spécialement conçus pour briser la formation de la structure secondaire pourrait faciliter l'hybridation de la DNAzyme à l'ARN cible en augmentant l'efficacité du marquage. En utilisant cette approche comprenant un oligonucléotide perturbateur, un marquage catalysé par l'ADN de la longueur de 156 nt ydaO L'ARN riboswitch avec Cy3-G et Cy5-G a été successivement réalisé, produisant un ARN long double marqué permettant d'autres études FRET. 130

4.2.2 Marquage catalysé par désoxyribozyme introduisant des ramifications phosphothioate

En 2017, Höbartner et ses collaborateurs ont signalé une hydrolyse presque rapide et complète de la modification de la branche 2′,5′-phosphodiester catalysée par 10-DM24 dans une longueur de 209 nt UBC4 transcrit pré-ARNm après incubation avec Saccharomyces cerevisiae débrancher (Dbr1). 131 Par conséquent, l'utilisation de cette technique d'étiquetage est limitée aux in vitro candidatures uniquement. Cependant, comme il est connu que Dbr1 est incapable d'hydrolyser les liaisons phosphorothioate avec Rp-configuration, 151 cette caractéristique peut être exploitée pour empêcher l'hydrolyse de la phosphodiestérase du marqueur. Par conséquent, les dérivés GTP fluorescents modifiés au phosphorothioate de Sp-GTP S ont été synthétisés sous forme de marquage catalysé par 10-DM24 de l'ARN avec Sp-GTP S entraîne une inversion de la configuration phosphorothioate donnant 2'-Rp-ARN marqué au GMPS. De plus, les conditions de marquage du 10-DM24 ont été optimisées pour incorporer efficacement Sp-GTP S par addition de l'ion métallique thiophile Cd 2+ pour empêcher les effets d'interférence du phosophothioate sur la coordination des ions métalliques par le complexe ternaire 10-DM24/ARN/GTP S. Bien que les réactions avec Sp-Les dérivés du GTP S ont généralement montré une vitesse de réaction plus lente par rapport aux dérivés du GTP, le 2'- résultantRpL'ARN marqué au -GMP S s'est avéré principalement résistant à la déramification par la levure Dbr1. 131 Pourtant, les applications de substrats d'ARN sensibles dans un contexte cellulaire sont limitées par la nécessité de former une jonction à trois hélices 129 et la nécessité d'aider les ions de métaux lourds à améliorer l'activité des désoxyribozymes. 130-132

4.3 Ribozymes pour le marquage d'oligonucléotides d'ARN non modifiés

Une approche prometteuse pour marquer l'ARN endogène in vivo peut être trouvée en utilisant des ribozymes génétiquement codés.

4.3.1 Marquage catalysé par un ribozyme introduisant des ramifications phosphodiester

Maghami et al. signalé directement in vitro sélection de ribozymes d'adénylyl transférase 2′-5′ agissant en trans pour le marquage d'ARN covalent et spécifique au site avec N 6 -(6-aminohexyl)-ATP et N Analogues d'ATP marqués au 6-fluorophore au niveau de groupes 2'-OH internes spécifiques, résultant en un ARN ramifié par liaison 2'-5'-phosphodiester. 133 En présence d'ARN cellulaire total, le ribozyme le plus efficace et le plus spécifique, FH14, a été utilisé pour marquer par fluorescence les 120 nt de long E. coli ARNs 5 s à trois positions différentes en utilisant un analogue d'ATP modifié par un fluorophore. Par conséquent, trois variantes du ribozyme FH14 ont été conçues avec des bras de liaison individuels de 8 à 10 nt flanquant les différents sites de marquage. En combinant deux ou trois variantes de ribozyme, un marquage multiple pourrait être réalisé. 133 Certes, il est connu que les liaisons ramifiées 2'-5'-phosphodiester ont été facilement clivées par des enzymes de déramification naturelles, entraînant la perte du marqueur installé 131, ce qui entrave la portée de cette approche de marquage pour les applications cellulaires. De plus, non seulement les analogues de l'ATP modifiés, mais aussi l'ATP ubiquitaire cellulaire sont utilisés comme substrat par le ribozyme et sont en compétition pour l'incorporation. 152 En retour, le N L'ATP 6-modifié peut également être incorporé par des réactions enzymatiques cellulaires dépendantes de l'ATP qui provoqueront un marquage de fond non spécifique indépendant du ribozyme. 153

4.3.2 Marquage catalysé par un ribozyme introduisant des branches d'ester phosphonate

Récemment, Höbartner et ses collaborateurs ont développé des ribozymes avancés pour le marquage bioorthogonal de l'ARN en attachant des dérivés du phosphonate de nucléoside acyclique ténofovir via des jonctions ester de phosphonate ramifié au 2′-OH d'une adénosine dans l'ARN cible (Figure 9). 134 Le ténofovir est un promédicament antiviral lipophile et perméable aux cellules utilisé contre les infections par le VIH et le virus de l'hépatite B (VHB). 154 Application du ténofovir-transférase ribozyme FJC9 et du ténofovir modifié par fluorescence, le 120 nt de long E. coli L'ARNr 5S a été efficacement marqué en présence d'ARN total cellulaire. De plus, en utilisant le ténofovir modifié par Cy5 et le ténofovir-transférase ribozyme FJ1, six sites cibles différents dans E. coli Les ARNr 16S et 23S, de 1500 nt et 2900 nt de long, respectivement, ont été modifiés.134 Notamment, les liaisons ester phosphonate formées par les ribozymes de ténofovir-transférase étaient plus stables vis-à-vis de Dbr1 par rapport aux liaisons phosphodiester naturelles formées lors d'approches de marquage précédemment décrites utilisant des ADNzymes et des ribozymes. Cet aspect combiné à l'avantage d'éviter les interactions croisées avec des substrats cellulaires non spécifiques, comme décrit pour les précédents analogues de marquage des nucléotides, 130, 132, 133, 149, 152, 153 rend cette méthode en principe possible pour des applications futures dans un environnement cellulaire. le contexte. De plus, un marquage orthogonal simultané installant à la fois une modification de ramification d'ester phosphonate et de phosphodiester par application de deux ribozymes orthogonaux pourrait être réalisé sur un seul ARN cible commun (figure 9) ou sur deux ARN cibles individuels. Plus en détail, le marquage simultané de l'ARNr 23S par le ribozyme FJ1 en utilisant le Cy5-Ténofovir en combinaison avec le marquage de l'ARNr 16S par le FH14 avec le FAM-ATP en présence d'ARN total cellulaire a été démontré. 133

Double marquage orthogonal site-spécifique d'un ARN endogène d'intérêt en utilisant des ribozymes de nucléotidyle et de ténofovir transférase. 134 Le in vitro le ribozyme FH14 de 2′-5′ adénylyl transférase sélectionné peut être utilisé pour le marquage interne des groupes 2′-OH avec N Analogues d'ATP modifiés en 6 produisant un ARN ramifié par liaison 2'-5'-phosphodiester. De plus, le in vitro Le ténofovir transférase ribozyme FJ1 sélectionné peut être appliqué pour le marquage interne du groupe 2′-OH avec N phosphonate de nucléoside acyclique 6 -modifié Dérivés de ténofovir produisant un ARN ramifié par liaison ester 2'-5'-phosphonate.

4.3.3 Marquage catalysé par les ribozymes par les ribozymes de méthyltransférase

Plus récemment, Scheitl et al. signalé in vitro sélection d'un ribozyme de méthyltransférase pour la méthylation de l'ARN spécifique au site. 135 La méthyltransférase ribozyme MTR1 catalyse le transfert d'un groupe méthyle du cofacteur O 6 -méthylguanine (m 6 G) vers une adénine spécifique produisant la 1-méthyladénosine modifiée (m 1 A) dans sa séquence d'ARN cible. La méthylation spécifique au site des adénosines a été montrée pour un ARNt cible en présence de E. coli ARNt in vitro. 135 Cependant, le ribozyme de méthyltransférase n'a pas encore été appliqué pour le marquage d'ARN spécifique au site autre que la méthylation, mais représente un outil prometteur pour les applications futures dans le marquage d'ARN en utilisant e. g. dérivés de benzylguanine marqués par fluorescence. 135 Néanmoins, lors du développement d'une telle application, le contournement des interactions croisées indésirables avec des substrats cellulaires non spécifiques doit être abordé.

4.4 Méthyltransférases pour le marquage enzymatique des oligonucléotides d'ARN

Les ARN méthyltransférases catalysent le transfert de groupes méthyle vers des nucléotides cibles dans l'ARN. 147 De nombreuses méthyltransférases emploient le cofacteur S-adénosyl-L-méthionine (AdoMet ou SAM) comme donneur de groupe méthyle. 147 La méthylation de l'ARN peut être appliquée pour la modification post-transcriptionnelle de l'ARN codant et non codant. 147, 155 Exploitant la promiscuité du substrat de certaines méthyltransférases, ces enzymes peuvent être utilisées pour le marquage de l'ARN en introduisant une variété de fonctionnalités. Ainsi, le transfert de groupes activés dirigé par la méthyltransférase (mTAG) peut être utilisé pour le marquage covalent et spécifique à la séquence de l'ARN préexistant. 136, 139, 140

Liu et ses collègues ont découvert pour la première fois que l'ARN humain N La 6 -méthyladénosine (m 6 A) méthyltransférase METTL3-METTL14 (METTL3-14) présente dans une certaine mesure une promiscuité co-substrat et est capable de transférer de manière spécifique un groupe allyle au N 6 -position de l'adénosine. 138 Par conséquent, un motif consensus distinctif doit être présent dans l'ARN d'intérêt qui sert de séquence de reconnaissance pour la méthyltransférase et définit le site de méthylation. Pour METTL3-14, le motif consensus comprend cinq nucléobases dans le motif DR A CH (D=A, G ou UR=G ou AH=A, C ou U souligné A représente le site de modification), dans lesquelles le A central sera modifié. 156 METTL3-14 est capable de générer N ARN marqué au 6-allyle utilisant le cofacteur synthétique allyl-SAM. 138

Récemment, Rentmeister et ses collègues ont présenté le marquage chimio-enzymatique spécifique à la séquence et le photocage de l'ARN en appliquant les ARNm méthyltransférases METTL3-14 et METTL16 (Figure 10). 137 Utilisant la promiscuité du co-substrat des deux méthyltransférases, ils ont testé différents analogues du co-substrat naturel des méthyltransférases AdoMet pour transférer des groupes fonctionnels au N 6 -position des adénosines cibles au sein de l'ARN d'intérêt. 137

Marquage d'ARN interne sans marqueur basé sur les ARNm méthyltransférases METTL3-14 et METTL-16. L'approche du transfert de groupes activés dirigé par la méthyltransférase (mTAG) peut être utilisée pour la modification covalente et spécifique à la séquence de l'ARN endogène. 144 méthyltransférases sont appliquées pour transférer divers groupes fonctionnels de Sanalogues de l'adénosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) aux N 6 -position des adénosines cibles au sein d'un ARN d'intérêt. Par conséquent, une séquence de reconnaissance distincte définissant le site de modification de la méthyltransférase doit être incluse dans la séquence d'ARN. De plus, METTL3-14 est capable de transférer des analogues benzyliques photoactifs d'AdoMet comme ortholes groupes -nitrobenzyle (ONB) et 6-nitropipéronyle (NP). Lors de l'irradiation avec de la lumière, la modification photoactive précédemment attachée est retirée de l'ARN d'intérêt. Les deux méthyltransférases, METTL3-14 et METTL-16, peuvent être utilisées dans une approche combinée pour le marquage orthogonal de différents sites dans le même brin d'ARN. Après modification séquentielle avec un groupe propargyle et un groupe ONB photoactif, ce dernier peut être éliminé de manière réversible par irradiation à la lumière. 137

Par conséquent, des séquences d'ARN avec les motifs consensus individuels respectifs pour chaque méthyltransférase ont été préparées, y compris le motif DRACH décrit précédemment pour METTL3-14. Le motif consensus pour METTL 16 comprend les neuf nucléobases UAC A GAGAA (A souligné représente le site de modification) qui doivent être posées dans une structure en boucle ou en épingle à cheveux au sein de l'ARN cible. 157 Pour tester le transfert des groupes propargyles, l'analogue d'AdoMet à base de sélénium SeAdoYn a été utilisé, qui s'est avéré auparavant plus stable et améliorer l'efficacité du transfert. 158 Les deux, METTL3-14 et METTL16, se sont avérés transférer des groupes propargyl avec des efficacités correspondant à 82 % ou jusqu'à 69 % de rendement relatif par rapport à AdoMet non modifié, respectivement. METTL3-14 a en outre accepté les analogues photoactifs d'AdoMet benzylique comme orthoGroupes -nitrobenzyle (ONB) et 6-nitropipéronyle (NP) pour le transfert avec un rendement relatif supérieur à 50 % par rapport à AdoMet. De plus, METTL16 a pu transférer un groupe azidobutényle, mais n'a produit que de faibles quantités d'ARN marqué. 137 La fonctionnalisation ultérieure de l'ARN propargylé et modifié par l'azidobutényle avec différents groupes rapporteurs en utilisant respectivement CuAAC ou SPAAC, a été démontrée avec succès. 137 Finalement, l'ARNm de la luciférase de luciole (FLuc) de 1900 nt de long qui comprend naturellement le motif DRACH a été post-synthétiquement propargylé, puis marqué par clic avec du Cy5-azide en utilisant CuAAC. 137 De plus, des expériences innovantes de photocage d'ARN ont prouvé que l'installation de groupes ONB et NP par METTL3-14 sur des ARN courts modifiés est réversible car les deux modifications peuvent être éliminées par irradiation avec de la lumière UV sans endommager l'ARN. 137 Il a en outre été démontré que les deux méthyltransférases, METTL3-14 et METTL-16, peuvent être utilisées en combinaison pour le marquage orthogonal d'un ARN de 26 nt de long sur différents sites. Une modification séquentielle a été effectuée en appliquant d'abord METTL16 pour transférer un groupe propargyle suivi du transfert d'un groupe ONB par METTL3-14. 137 L'approche de marquage présentée est prometteuse pour des applications futures telles que le marquage bicolore pour les études FRET sur l'ARN endogène ainsi que l'activation de l'ARN précédemment photocagé. La spécificité de site de l'approche présentée est limitée car les motifs de consensus requis ne couvrent que quelques nucléobases. Une interférence potentielle avec des motifs consensus naturellement présents dans de longues séquences d'ARN fonctionnelles 159 est imaginable et provoquera un marquage non spécifique par des méthyltransférases au niveau de sites indésirables. Se référant à plus tôt in vivo des expériences de marquage métabolique avec un précurseur d'acide aminé propargyle modifié comme substrat de la méthyltransférase produisant finalement de l'ARN propargylé, 160 une adaptation intéressante pour un site spécifique in vivo Le marquage à l'ARN pourrait être développé à l'avenir. Pour cela, il faut prendre soin de traiter les interactions croisées indésirables avec les substrats cellulaires AdoMet ou SAM.


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Remerciements

PAQUET. remercie la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31671382) et le Fonds de recherche scientifique de l'Université Huaqiao. F.Q. remercie la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 32000462) et le Fonds de recherche scientifique de l'Université Huaqiao. Y.C. remercie le Fonds innovant pour les étudiants de troisième cycle en recherche scientifique de l'Université Huaqiao. K.S.-A. remercie le New York University Abu Dhabi Research Institute et la NYUAD Division of Science (fonds n° 73 71210 CGSB9 et AD060) pour leur soutien.


Remerciements

Nous remercions Sun-Je Woo pour son soutien au laboratoire BL3, Kwangmi Moon pour ses conseils sur la culture du virus BL2 et Soohyun Jang pour son soutien technique. Nous remercions également le Dr Kwangseog Ahn pour le partage des réactifs. Ce travail n'aurait pas été possible sans des discussions inestimables avec les membres du laboratoire de Narry Kim, en particulier Dongwan Kim, Haedong Kim et le Dr Hyunjoon Kim. La ressource pathogène pour cette étude a été fournie par la National Culture Collection for Pathogens, Korea National Institute of Health for SARS-CoV-2 (NCCP43326), et la Korea Bank for Pathogenic Viruses, Korea University Medical Center for HCoV-OC43 (KBPV- VR-8). Ce travail a été soutenu par l'Institut des sciences fondamentales du ministère des Sciences et des TIC de Corée (IBS-R008-D1 à V.N.K.) et une bourse de recherche BK21 du ministère de l'Éducation de Corée (A.S.).

Contributions d'auteur

Conceptualisation, S.L., Y.L. et V.N.K. Méthodologie et expérimentations, S.L., A.S. et Y.P. LC-MS/MS, J.K. et J.-S.K. Analyse de données, Y.L. et Y.C. Rédaction de manuscrits, S.L., Y.L. et V.N.K. Visualisation, Y.L., Y.C. et A.S. Surveillance, V.N.K.

Déclaration d'intérêts

Nous avons déposé un brevet relatif à cet article.

Inclusion et diversité

Un ou plusieurs des auteurs de cet article s'identifient comme une minorité ethnique sous-représentée en science.


Voir la vidéo: Transcription and mRNA processing. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Août 2022).