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Quel est l'identifiant de gène le plus stable ?

Quel est l'identifiant de gène le plus stable ?



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J'ai eu du mal par le passé à concevoir des bases de données autour d'identifiants de gènes qui évoluent dans le temps. Par exemple, UniProt et Ensembl changent leurs identifiants pour certaines protéines/gènes et les identifiants deviennent périmés après un certain temps (années). HGNC semble peut-être mieux pour cela? Ce que j'aimerais, c'est avoir un identifiant unique et unique pour chaque gène humain qui restera stable pendant de nombreuses années. Je sais que les gènes sont parfois reclassés, mais vous ne devriez pas vous retrouver avec un nouvel identifiant pour le même locus.

Suggestions?

Merci


Le maintien de la cohérence des ID est un problème courant. Je n'ai jamais vu de solutions raisonnables pour cela et je ne crois pas qu'il y en ait. Cependant, il existe quelques raccourcis.

  1. Vous pouvez créer une table supplémentaire avec des alias pour les renommer ultérieurement et les référer aux identifiants d'origine. Avantages - il est flexible. Inconvénients - la maintenance est épuisante et vous devez trouver un moyen d'expliquer aux utilisateurs pourquoi ils saisissent un identifiant et en reçoivent un autre.
  2. La solution est assez évidente - si vous souhaitez avoir "un seul identifiant unique pour chaque gène humain qui restera stable pendant de nombreuses années", vous pouvez simplement prendre un instantané de l'état actuel de n'importe quelle base de données que vous aimez et ne pas y toucher pendant de nombreuses années. Vous pouvez publier des versions spécifiques à la version de votre base de données et spécifier les versions de la base de données de référence que vous utilisez. Par exemple. "Glioblastome_drug_perturbation_2016_(GRCh38_ENS87)".

Identification et évaluation de gènes de référence pour une analyse PCR quantitative en temps réel dans Polygone cuspidatum basé sur les données du transcriptome

Polygone cuspidatum de la famille des Polygonaceae est une plante médicinale traditionnelle avec de nombreux composés bioactifs qui jouent un rôle important dans la santé humaine et les réponses au stress. La recherche a tenté d'identifier les gènes de biosynthèse et les voies métaboliques chez cette espèce, et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) a été couramment utilisée pour détecter l'expression des gènes en raison de sa vitesse, de sa sensibilité et de sa spécificité. Cependant, non P. cuspidatum des gènes de référence ont été identifiés, ce qui entrave les études d'expression génique. Ici, nous avons cherché à identifier des gènes de référence appropriés pour une normalisation précise et fiable de P. cuspidatum Données RT-qPCR.

Résultats

Douze gènes candidats de référence, dont neuf communs (ACTE, AUT, BAIGNOIRE, GAPDH, EF-1γ, UBQ, UBC, 60SrRNA, et eIF6A) et trois romans (SKD1, YLS8, et NDUFA13), ont été analysés dans différents tissus (racine, tige et feuille) sans traitement et dans des feuilles soumises à des stress abiotiques (sel, ultraviolet [UV], froid, chaleur et sécheresse) et des stimuli hormonaux (acide abscissique [ABA], éthylène [ ETH], gibbérelline [GA3], le jasmonate de méthyle [MeJA] et l'acide salicylique [SA]). La stabilité de l'expression dans 65 échantillons a été calculée à l'aide de la méthode CT CT, geNorm, NormFinder, BestKeeper et RefFinder. Deux gènes de référence (NDUFA13 et EF-1γ) étaient suffisants pour normaliser l'expression des gènes dans tous les ensembles d'échantillons. Ils étaient également les deux gènes les plus stables pour les stress abiotiques et les différents tissus, alors que NDUFA13 et SKD1 étaient les deux premiers choix pour les stimuli hormonaux. Considérant les ensembles expérimentaux individuels, GAPDH était le gène le mieux classé sous ABA, ETH et GA3 traitements, tandis que 60SrRNA ont montré une bonne stabilité sous MeJA et les traitements au froid. ACTE, UBC, et BAIGNOIRE étaient des gènes appropriés pour les traitements contre la sécheresse, les UV et l'ABA, respectivement. AUT ne convenait pas en raison de sa variation considérable d'expression dans différentes conditions. Les modèles d'expression de PcPAL, PcSTS, et PcMYB4 sous traitements UV et SA et dans différents tissus normalisés par des gènes de référence stables et instables ont démontré la pertinence des gènes de référence optimaux.

Conclusion

Nous proposons NDUFA13 et EF-1γ comme gènes de référence pour normaliser P. cuspidatum données d'expression. A notre connaissance, il s'agit de la première étude systématique de gènes de référence dans P. cuspidatum qui pourrait aider à faire avancer la recherche en biologie moléculaire dans P. cuspidatum et espèces apparentées.


Validation de gènes de référence pour l'analyse de l'expression génique par amplification en chaîne par polymérase quantitative dans des lignées de pois (Pisum sativum) avec une susceptibilité à la verse différente

Michał Knopkiewicz, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz de Poznań, Umultowska 89, 61-614 Poznań, Pologne.

Faculté de biologie, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz à Poznań, Poznań, Pologne

Faculté de biologie, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz à Poznań, Poznań, Pologne

Michał Knopkiewicz, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz de Poznań, Umultowska 89, 61-614 Poznań, Pologne.

Faculté de biologie, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz à Poznań, Poznań, Pologne

Résumé

Les données PCR en temps réel de chaque expérience d'analyse d'expression génique doivent être normalisées avec des gènes de référence appropriés, qui sont exprimés uniformément dans un ensemble d'échantillons en cours d'analyse. Les gènes de référence doivent être testés indépendamment pour chaque ensemble expérimental. Nous avons estimé l'expression génique de cinq gènes de référence potentiels (Phosphoprotéine phosphatase 2A, histone H3, -tubuline, facteur de transcription IIA et actine) dans 33 pois (Pisum sativum L.) échantillons. Le matériel végétal comprenait des fragments de tige de quatre accessions de pois (trois cultivars avec une sensibilité à la verse et une rigidité de tige différentes et une accession de type sauvage). Différents stades de développement phénologique des plantes et conditions environnementales ont été testés dans trois sous-ensembles d'échantillons. Phosphoprotéine phosphatase 2A et -tubuline étaient les gènes les plus stables dans le sous-ensemble de plantes de 30 jours, cultivées en serre. Les plantes en début de floraison ont été cultivées en serre et au champ. Phosphoprotéine phosphatase 2A et facteur de transcription IIA présentait l'expression la plus stable dans des conditions de terrain, tandis que histone H3 et -tubuline étaient les plus stables dans des conditions de serre. Phosphoprotéine phosphatase 2A et -tubuline étaient également les gènes les plus stables parmi tous les échantillons testés. Nous avons identifié des gènes exprimés de manière stable, qui peuvent être utilisés comme référence pour la normalisation des données PCR en temps réel dans notre sous-ensemble d'échantillons. Notre recherche est un bon point de départ pour d'autres études sur l'expression des gènes dans le tissu de tige de pois. Il s'agit de la première étape pour réaliser des études d'expression génique liées à la résistance à la verse du pois.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant pour l'article.


Identification (biologie)

Identification en biologie, il s'agit d'attribuer un nom de taxon préexistant à un organisme individuel. L'identification d'organismes à des noms (ou codes) scientifiques individuels peut être basée sur des caractéristiques corporelles naturelles individualistes, [1] des marqueurs individuels créés expérimentalement (par exemple, des motifs de points de couleur) ou des marqueurs moléculaires individualistes naturels (similaires à ceux utilisés dans l'identification de la maternité ou de la paternité). essais). L'identification individuelle est utilisée en écologie, en gestion de la faune et en biologie de la conservation. La forme d'identification la plus courante est l'identification d'organismes par des noms communs (par exemple, "lion") ou un nom scientifique (par exemple, "Panthera lion"). Par nécessité, cela est basé sur des caractéristiques héritées ("caractères") des organismes sexuels, l'héritage formant la base de la définition d'une classe. Les caractéristiques peuvent, par exemple, être morphologiques, anatomiques, physiologiques, comportementales ou moléculaires.

Le terme « détermination » peut parfois être utilisé comme synonyme d'identification (par exemple), [2] ou comme dans les « fiches de détermination ». [3]

Les méthodes d'identification peuvent être manuelles ou informatisées et peuvent impliquer l'utilisation de clés d'identification, la navigation dans un guide de champs contenant des récits d'espèces (souvent illustrés), la comparaison de l'organisme avec des spécimens de collections d'histoire naturelle ou la prise d'images à analyser et à comparer à un organisme pré-formé. base de connaissances avec des informations sur les espèces. [4]


Validation de gènes de référence pour l'analyse de l'expression génique par amplification en chaîne par polymérase quantitative dans des lignées de pois (Pisum sativum) avec une susceptibilité à la verse différente

Michał Knopkiewicz, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz de Poznań, Umultowska 89, 61-614 Poznań, Pologne.

Faculté de biologie, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz à Poznań, Poznań, Pologne

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Michał Knopkiewicz, Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université Adam Mickiewicz de Poznań, Umultowska 89, 61-614 Poznań, Pologne.

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Résumé

Les données PCR en temps réel de chaque expérience d'analyse d'expression génique doivent être normalisées avec des gènes de référence appropriés, qui sont exprimés uniformément dans un ensemble d'échantillons en cours d'analyse. Les gènes de référence doivent être testés indépendamment pour chaque ensemble expérimental. Nous avons estimé l'expression génique de cinq gènes de référence potentiels (Phosphoprotéine phosphatase 2A, histone H3, -tubuline, facteur de transcription IIA et actine) dans 33 pois (Pisum sativum L.) échantillons. Le matériel végétal comprenait des fragments de tige de quatre accessions de pois (trois cultivars avec une sensibilité à la verse et une rigidité de tige différentes et une accession de type sauvage). Différents stades de développement phénologique des plantes et conditions environnementales ont été testés dans trois sous-ensembles d'échantillons. Phosphoprotéine phosphatase 2A et -tubuline étaient les gènes les plus stables dans le sous-ensemble de plantes de 30 jours, cultivées en serre. Les plantes en début de floraison ont été cultivées en serre et au champ. Phosphoprotéine phosphatase 2A et facteur de transcription IIA présentait l'expression la plus stable dans des conditions de terrain, tandis que histone H3 et -tubuline étaient les plus stables en serre. Phosphoprotéine phosphatase 2A et -tubuline étaient également les gènes les plus stables parmi tous les échantillons testés. Nous avons identifié des gènes exprimés de manière stable, qui peuvent être utilisés comme référence pour la normalisation des données PCR en temps réel dans notre sous-ensemble d'échantillons. Notre recherche est un bon point de départ pour d'autres études sur l'expression des gènes dans le tissu de tige de pois. Il s'agit de la première étape pour réaliser des études d'expression génique liées à la résistance à la verse du pois.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant pour l'article.


Identification de gènes de référence pour les études d'expression génique lors de la germination des graines et de l'établissement des plantules Ricinus communis L.

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  • Vancouver

Dans : Seed Science Research , Vol. 24, n° 4, 2014, p. 341-352.

Résultats de recherche : Contribution à la revue › Article › Académique › peer-review

T1 - Identification de gènes de référence pour les études d'expression génique lors de la germination des graines et de l'établissement des plantules Ricinus communis L.

N2 - La transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) est une technologie importante pour analyser les niveaux d'expression des gènes pendant le développement des plantes ou en réponse à différents traitements. Une exigence importante pour mesurer avec précision les niveaux d'expression des gènes est un ensemble correctement validé de gènes de référence. Dans ce contexte, nous avons analysé l'utilisation potentielle de 17 gènes de référence candidats à travers un ensemble diversifié d'échantillons, y compris plusieurs tissus, différents stades et conditions environnementales, englobant la germination des graines et la croissance des plantules chez Ricinus communis L. Ces gènes ont été testés par RT-qPCR et classés selon la stabilité de leur expression en utilisant deux approches différentes : GeNorm et NormFinder. GeNorm et Normfinder ont indiqué que ACT, POB et PP2AA1 constituent la combinaison optimale pour la normalisation des données d'expression génique dans les études inter-tissus (panel d'échantillons hétérogènes). Nous décrivons également la combinaison optimale de gènes de référence pour un sous-ensemble d'échantillons de racines, d'endospermes et de cotylédons. En général, les gènes les plus stables suggérés par GeNorm sont très cohérents avec ceux indiqués par NormFinder, ce qui met en évidence la force de la sélection de gènes de référence dans notre étude. Nous avons également validé les gènes de référence sélectionnés en normalisant les niveaux d'expression de trois gènes cibles impliqués dans le métabolisme énergétique avec les gènes de référence suggérés par GeNorm et NormFinder. L'approche utilisée dans cette étude pour identifier les gènes exprimés de manière stable, et donc les gènes de référence potentiels, a été appliquée avec succès pour R. communis et elle fournit des directives importantes pour les études RT-qPCR dans les graines et les semis pour d'autres espèces (en particulier dans les cas où de vastes puces à ADN les données ne sont pas disponibles)

AB - La réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) est une technologie importante pour analyser les niveaux d'expression des gènes au cours du développement des plantes ou en réponse à différents traitements. Une exigence importante pour mesurer avec précision les niveaux d'expression des gènes est un ensemble correctement validé de gènes de référence. Dans ce contexte, nous avons analysé l'utilisation potentielle de 17 gènes de référence candidats à travers un ensemble diversifié d'échantillons, y compris plusieurs tissus, différents stades et conditions environnementales, englobant la germination des graines et la croissance des plantules chez Ricinus communis L. Ces gènes ont été testés par RT-qPCR et classés selon la stabilité de leur expression en utilisant deux approches différentes : GeNorm et NormFinder. GeNorm et Normfinder ont indiqué que ACT, POB et PP2AA1 constituent la combinaison optimale pour la normalisation des données d'expression génique dans les études inter-tissus (panel d'échantillons hétérogènes). Nous décrivons également la combinaison optimale de gènes de référence pour un sous-ensemble d'échantillons de racines, d'endospermes et de cotylédons. En général, les gènes les plus stables suggérés par GeNorm sont très cohérents avec ceux indiqués par NormFinder, ce qui met en évidence la force de la sélection de gènes de référence dans notre étude. Nous avons également validé les gènes de référence sélectionnés en normalisant les niveaux d'expression de trois gènes cibles impliqués dans le métabolisme énergétique avec les gènes de référence suggérés par GeNorm et NormFinder. L'approche utilisée dans cette étude pour identifier les gènes exprimés de manière stable, et donc les gènes de référence potentiels, a été appliquée avec succès pour R. communis et elle fournit des lignes directrices importantes pour les études RT-qPCR dans les graines et les semis d'autres espèces (en particulier dans les cas où des puces à ADN étendues les données ne sont pas disponibles)


Quel est l'identifiant de gène le plus stable ? - La biologie

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L'article de fond peut être soit un article de recherche original, soit une nouvelle étude de recherche substantielle qui implique souvent plusieurs techniques ou approches, ou un article de synthèse complet avec des mises à jour concises et précises sur les derniers progrès dans le domaine qui passe systématiquement en revue les avancées les plus passionnantes dans le domaine scientifique. Littérature. Ce type d'article donne un aperçu des orientations futures de la recherche ou des applications possibles.

Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


Quel est l'identifiant de gène le plus stable ? - La biologie


Caractériser la régulation d'un gène d'intérêt en visualisant son

  • expression à travers les tissus et les types de cellules
  • expression à travers les stades de développement
  • réponse aux stress biotiques et abiotiques
  • expression comparative dans différents génotypes


Trouver des gènes spécifiquement exprimés dans

  • tissus ou types cellulaires d'intérêt
  • stades de développement
  • réponse aux tresses biotiques et abiotiques
  • comparaisons de génotypes


Analyser une expérience d'intérêt

  • expression d'un gène d'intérêt à travers des échantillons d'une expérience choisie
  • gènes différentiellement exprimés dans des conditions de notre base de données organisée
  • gènes exprimés de manière différentielle dans les conditions de votre propre expérience
  • contrôle qualité : voyez comment les échantillons se regroupent en fonction de leurs profils d'expression
  • vérifier quels facteurs causent la principale différence entre les échantillons


Comparez vos résultats avec des données publiques organisées


Comparer les résultats entre les espèces


Trouver des voies associées à une liste de gènes

  • analyse de surreprésentation par rapport aux voies Reactome et aux termes GO
  • Diagramme de Venn jusqu'à quatre listes/voies


Trouver les gènes ayant l'expression la plus similaire à travers

  • tissus et types de cellules
  • stades de développement
  • conditions expérimentales
  • échantillons


Comparer l'expression de deux gènes d'intérêt à travers

  • tissus et types de cellules
  • stades de développement
  • conditions expérimentales
  • échantillons


Trouvez et comparez les gènes de référence pour la RT-qPCR

  • le plus stable dans un tissu choisi
  • comparer avec des gènes de référence non spécifiques fréquemment utilisés


Trouver des orthologues de gènes fonctionnels d'autres espèces

  • basé sur les informations protéiques et phylogéniques (basé sur l'OMA)
  • basé sur une expression tissulaire similaire (basé sur GENEVESTIGATOR ® )

Données végétales sélectionnées

Chez NEBION, nous collectons, conservons et intégrons en permanence des données sur les espèces végétales. En 2020, nous avons ajouté du tournesol et de la pastèque tout en augmentant le contenu pour d'autres espèces cultivées et pour Arabidopsis. La figure ci-dessous montre le nombre d'échantillons (ensembles de données microarray et RNA-Seq) par espèce. Pour en savoir plus sur nos outils de curation et d'analyse, consultez notre flyer ou voir quelques captures d'écran.

Exemples d'analyses et captures d'écran

Analyse d'expression différentielle de l'effet d'un isolat de M. oryzae dans une expérience sur le riz (GSE95394). Graphique du volcan montrant des gènes significativement régulés à la hausse et à la baisse, avec une liste restreinte de gènes hautement significatifs marqués et sélectionnés pour la comparaison avec d'autres conditions expérimentales (voir la figure ci-dessous).

Comparaison des résultats obtenus à partir de l'analyse d'expression différentielle ci-dessus avec un recueil d'autres données sur le riz. Un certain nombre de perturbations biotiques et génétiques provoquent une réponse similaire. Par extension, la signature peut être traduite pour une autre espèce à l'aide de notre fonction ou outil d'orthologues, et la signature adaptée aux conditions expérimentales trouvées dans ces autres recueils. Cela permet une meilleure compréhension de la liste des gènes obtenus dans notre analyse originale.

Diagramme de Venn des gènes régulés en réponse au stress froid, salin et osmotique de l'expérience AT-00814, ainsi que l'analyse d'enrichissement contre les voies Reactome.

Identification des gènes spécifiquement exprimés dans l'albumen du blé, calculé à partir de 55 catégories anatomiques agrégées à partir de 2332 échantillons.

Regroupement de gènes spécifiques à l'endosperme identifiés dans l'exemple précédent. Deux groupes principaux apparaissent, l'un comprenant des gènes également exprimés dans la couche d'aleurone.

Graphique à 2 gènes comparant l'expression de LTP3 et LTP4 dans 1727 échantillons d'ARN-Seq d'Arabidopsis.

Identification de gènes de référence candidats ayant une expression stable dans les feuilles adultes d'Arabidopsis, mesurée à partir de 1006 échantillons. Des gènes de référence connus à titre d'exemples sont présentés dans la partie supérieure du graphique par comparaison, montrant qu'il existe des gènes alternatifs ayant une stabilité d'expression plus élevée dans les feuilles adultes.

NEBION est une société suisse de biocuration et d'intégration de données. Nous fournissons aux chercheurs et aux scientifiques des données transcriptomiques de qualité supérieure et soigneusement sélectionnées et des outils avancés pour des découvertes passionnantes dans les universités et l'industrie.


Les gènes PPIA, HPRT1 et YWHAZ conviennent à la normalisation de l'expression de l'ARNm dans les cellules souches mésenchymateuses humaines étendues à long terme

L'expansion à long terme des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans des conditions de culture définies est nécessaire dans la thérapie par cellules souches humaines. Cependant, il modifie les caractéristiques des MSC. Étant donné que la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) est largement utilisée comme l'une des méthodes analytiques clés pour la caractérisation comparative, la validation des gènes de référence (RG) pour la normalisation dans chaque condition expérimentale est importante pour obtenir des résultats qRT-PCR fiables. Par conséquent, les RG les plus stables pour les MSC dérivées du sang de moelle osseuse et de cordon ombilical expansé à long terme (BM-MSC et UCB-MSC) dans des conditions de culture définies pour un maximum de 20 passages ont été évalués. Les altérations les plus apparentes des caractéristiques telles que la capacité de différenciation, la prolifération, la sénescence et l'expression des RG ont été notées dans les BM-MSC que dans les UCB-MSC au cours de l'expansion à long terme. Les programmes de validation de RG (GeNorm et NormFinder) ont suggéré que PPIA, HPRT1 et YWHAZ étaient adaptés à la normalisation en qRT-PCR quels que soient les types de MSC et l'expansion de la culture à long terme, et les RG traditionnels (ACTB et GAPDH) étaient moins stables à long terme. -terme étendu MSCs. En outre, l'utilisation de ces RG pour la normalisation de l'expression d'OCT4 dans des BM-MSC étendus à long terme a montré qu'un RG moins stable (GAPDH) présentait des données contrastées par rapport aux autres RG. Par conséquent, l'utilisation de RG tels que PPIA, HPRT1 et YWHAZ pour la normalisation dans les expériences qRT-PCR est fortement recommandée pour les MSC étendus à long terme afin de générer des données précises et fiables.

1. Introduction

Puisque les études d'expression génique nous ont permis de comprendre le réseau de régulation génique des mécanismes cellulaires, l'analyse quantitative de l'expression génique est essentielle en biologie cellulaire [1]. Parmi les techniques couramment utilisées, la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été la technique la plus largement utilisée pour surveiller l'expression des gènes en raison de sa sensibilité, sa spécificité, sa reproductibilité, sa large plage dynamique et son degré élevé d'automatisation [2–4 ]. En qRT-PCR, la normalisation des gènes d'intérêt (GOI) par rapport à un gène de référence (RG) est impérative pour étudier la quantification relative de l'expression des gènes, car on pense que les RG sont exprimés de manière stable et constante dans les cellules, quelles que soient les conditions expérimentales [ 4-6]. Malheureusement, il n'y a aucun rapport sur l'utilisation d'un seul RG universel ayant une expression constante. Il a été découvert que l'expression des RG couramment utilisés varie même en fonction du type de cellule, de la source cellulaire et des conditions expérimentales. De plus, l'expression de RG est également affectée par la qualité de l'ARN obtenu, les conditions de synthèse de l'ADNc, le type de chimie de détection et les contaminants inhibiteurs [6-10]. Étant donné que la sélection de RG inadéquats et instables pour la normalisation du GOI peut conduire à la génération de fausses données ou de résultats contradictoires, la validation des RG les plus stables à partir du pool de RG largement utilisés dans chaque configuration expérimentale est une condition préalable à l'obtention de résultats précis et fiables en qRT-PCR [5, 11].

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont mises en évidence comme des candidats prometteurs pour la thérapie par cellules souches et ont eu un impact significatif dans le domaine de la médecine régénérative en raison de leur propriété d'auto-renouvellement, de leur large accessibilité, de leur potentiel de différenciation multilignée et de leurs propriétés d'immunomodulation [12]. Dans ce contexte, les MSC dérivées de la moelle osseuse (BM-MSC) ont été largement étudiées au cours des dernières décennies. Cependant, l'isolement des BM-MSC nécessite des procédures invasives et ces cellules sont associées à certaines limitations telles que le déclin dépendant de l'âge de leur capacité de prolifération et de différenciation [13]. Par conséquent, les MSC dérivées du sang de cordon ombilical (UCB-MSC) constituent des alternatives potentielles aux BM-MSC, car des échantillons d'UCB contenant plusieurs populations primaires de MSC sont cryoconservés dans le monde entier [14, 15].

Pour l'application clinique des CSM, plusieurs obstacles doivent être surmontés qui surviennent lors de la culture cellulaire. Les MSC primaires isolés doivent être considérablement étendus in vitro pour atteindre une quantité suffisante à des fins thérapeutiques en raison de leur apparition en faible population dans de nombreux tissus humains. Cependant, le in vitro-les CSM expansées ne sont pas immortelles et subissent par conséquent des altérations cellulaires telles que la perte de la capacité de prolifération et du potentiel de différenciation, la sénescence réplicative et la modification de l'expression des gènes, y compris les RG [16, 17]. En outre, plusieurs efforts ont été déployés pour remplacer les suppléments d'origine animale tels que le sérum bovin fœtal (FBS) par des conditions de culture définies telles que des milieux sans sérum et xéno afin de prévenir les effets indésirables possibles tels que les réactions immunitaires sévères, les infections virales et bactériennes. , et les zoonoses [18, 19]. Depuis in vitro environnements (in vitro expansion à long terme, milieux sans sérum et xéno) peuvent également influencer les caractéristiques cellulaires, les altérations cellulaires dans les CSM expansées à long terme dans des conditions de culture définies doivent être étudiées plus avant pour la sécurité, la fiabilité et l'efficacité avant les applications cliniques. Récemment, il a été fortement souligné que la sélection de RG appropriés dans chaque condition expérimentale pour la recherche MSC est une étape essentielle pour obtenir des résultats fiables avant d'effectuer qRT-PCR [4-6, 20]. Cependant, au meilleur de notre connaissance, la sélection de RG appropriés pour les MSC étendus à long terme dans des conditions de culture définies n'est pas bien étudiée. Par conséquent, la présente étude vise à enquêter sur les RG les plus stables pour fournir une évaluation précise du changement de pli relatif de l'ARNm du GOI dans les MSC humaines étendues à long terme (BM-MSC et UCB-MSC) dans des conditions de culture définies. Dix RG couramment utilisés (18S, B2M, EEF1A1, GAPDH, HPRT1, PPIA, RPLP0, TBP, ACTB et YWHAZ) ont été étudiés et comparés pour déterminer les RG appropriés pour les BM-MSC et UCB-MSC étendus à long terme sous culture définie conditions à travers des programmes de validation RG largement utilisés : GeNorm et NormFinder.

2. Matériels et méthodes

2.1. Produits chimiques et éthique

Tous les produits chimiques et milieux ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), sauf indication contraire. Tous les volontaires pour le don d'échantillons ont reçu un consentement éclairé écrit, et le comité d'éthique de l'hôpital universitaire national de Gyeongsang (GNUH-2012-09-004) a approuvé la présente étude.

2.2. Caractérisation des BM-MSC et UCB-MSC étendus à long terme

Des aspirats BM ou UCB ont été obtenus pendant la chirurgie ou la parturition pour isoler les BM-MSC (n = 5, mâle) ou les UCB-MSC (n = 5, mâle), respectivement. Les CSM ont ensuite été cultivées dans des milieux de culture définis (milieu StemPro MSC SFM Xenofree supplémenté en L-alanyl-L-glutamine, 100 unités/ml de pénicilline et 100 ??g/ml de streptomycine) et détaché avec TrypLE pendant la sous-culture pour une expansion à long terme. En bref, les aspirats de BM et les UCB ont été dilués avec de la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS 1:1 (v/v)) et déposés sur Ficoll (densité 1,077 g/cm 3 , GE Healthcare, IL, USA). Après centrifugation (400 ×g, 30 min) à 4°C, la fraction de cellules mononucléées (MNC) a été récoltée, étalée sur une plaque 6 puits à 1 × 10 5 cellules/cm 2 dans des milieux de culture définis, et cultivée à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5%

comme précédemment rapporté [13]. Une fois que les populations primaires de MSC adhérentes ont atteint 80% de confluence, elles ont été récoltées avec TrypLE et passées jusqu'à 20 passages avec des milieux de culture définis. Les BM-MSC étendus ont été classés comme passage précoce (E-BM-MSCs), passage intermédiaire (M-BM-MSCs) ou passage tardif BM-MSCs (L-BM-MSCs) aux passages 2-4, 10-12 , ou 18-20, respectivement. De même, les UCB-MSC ont également été classés en tant que passage précoce (E-UCB-MSC), passage intermédiaire (M-UCB-MSC) et passage tardif UCB-MSC (L-UCB-MSC) aux passages 2-4, 10-12 , ou 18-20, respectivement. Les CSM de tous les groupes ont été analysées pour leur expression de marqueurs de surface spécifiques aux CSM (CD44, CD105 et vimentine) et l'absence d'expression de marqueurs de cellules souches hématopoïétiques (CD34 et CD45). En bref, des CSM à 80 % de confluence ont été récoltées et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à la souris anti-humain CD34 (1:200 BD Biosciences, NJ, USA), souris anti-humain CD44 (1:200 BD Biosciences), souris anti-humain -humain CD45 (1:200 BD Biosciences), souris anti-humain CD105 (1:200 BD Biosciences) et Alexa Fluor® 488 souris anti-humain vimentine (1:200 BD Biosciences). Au total, 1 × 10 4 CSM marquées au FITC ont été acquises et analysées à l'aide de BD FACS Calibur (BD Biosciences). La capacité de différenciation de tous les CSM vers les lignées mésenchymateuses a été évaluée selon les protocoles précédents [12, 21]. En bref, la différenciation ostéogénique a été induite pendant 3 semaines avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10 % de FBS, 200 mM d'acide ascorbique, 10 mM ??-glycérophosphate, et 0,1 mM de dexaméthasone, et l'ostéogenèse a été confirmée en observant les dépôts de calcium après coloration avec une solution de nitrate de ruban à 5% (coloration de Von Kossa). La chondrogenèse a été induite en utilisant le kit de différenciation de chondrogenèse STEMPRO. Brièvement, 1 × 10 6 MSC ont été suspendus dans un tube de 15 ml et ont été centrifugés à 450 ×g pendant 5 min. Les culots ont été cultivés pendant 3 semaines dans des milieux de chondrogenèse STEMPRO. Les pastilles ont ensuite été utilisées pour préparer des coupes incluses en paraffine sur des lames de verre. Les coupes ont été colorées avec une solution de bleu alcian à 1 % pour la détection des protéoglycanes et ont été contre-colorées avec une solution de rouge rapide nucléaire à 0,1 %. Les CSM ont été cultivées pendant 3 semaines dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 100 mM d'indométhacine, 10 mM d'insuline et 1 mM de dexaméthasone pour l'adipogenèse. La différenciation en lignée adipocytaire a été confirmée en évaluant l'accumulation de vacuoles lipidiques intracellulaires après coloration avec une solution à 0,5% de rouge d'huile O.

2.3. Potentiel de prolifération et ??-Activité galactosidase dans les BM-MSC et UCB-MSC étendus à long terme

Le test de prolifération cellulaire Vybrant® MTT [3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure] a été utilisé pour l'évaluation comparative du potentiel de prolifération des CSM. En bref, 1 × 10 3 MSC ont été cultivées dans une plaque à 96 puits et tous les deux jours, les cellules ont été incubées avec 20 ??l Solution de MTT (5 mg/ml) pendant 4 h. Après incubation, le surnageant a été retiré et 50 ??1 de diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté. Le produit formé a ensuite été transféré dans une plaque à 96 puits et l'absorbance a été mesurée à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaque (VersaMax™, Molecular Devices, CA, USA). La sénescence associée ??-activité galactosidase (SA-??-gal) a été mesurée en utilisant ??-galactosidase Assay Kit suivant le protocole du fabricant. En bref, les cellules à 70-80% de confluence ont été récoltées par traitement avec TrypLE et lavées deux fois avec DPBS, et un total de 5 × 10 5 cellules ont été traitées avec 200 ??l Réactif M-PER puis agiter doucement pendant 10 min. Après centrifugation à 27 000 ×g pendant 15 min pour éliminer les débris de lyse cellulaire, 50 ??1 du surnageant a été transféré dans une microplaque à 96 puits. L'extrait cellulaire a été incubé à 37°C pendant 30 min avec 50 ??je de ??-galactosidase et l'absorbance a été mesurée à 405 nm en utilisant un lecteur de microplaques (VersaMax™, Molecular Devices, CA, USA).

2.4. Gènes de référence candidats et séquences d'amorces

Dix RG ont été choisis en fonction de différentes activités fonctionnelles intracellulaires et conformément aux rapports précédents [4-6]. Les amorces pour chaque RG ont été conçues par le logiciel Primer 3 Plus (en considérant une température de recuit de 60 °C) et ont été analysées pour la formation d'épingles à cheveux, d'homodimères et d'hétérodimères à l'aide du logiciel OligoAnalyzer 3.1. Afin de vérifier l'efficacité de la PCR, une courbe standard de chaque amorce a été réalisée à partir des valeurs de seuil de cycle (Ct) par une dilution en série quadruple d'ADNc (1:10, 1:100, 1:1000 et 1:10 000) des E-BM-MSCs suivant les protocoles précédents [6, 22]. Paramètres de courbe standard tels que la pente (M), l'interception (B), l'efficacité de la PCR (E =

) ont été calculés à l'aide du logiciel RotorGene Q Series (Qiagen, Hilden, Allemagne) ou Excel (Microsoft, WA, USA). Le nom complet, le symbole du gène, les séquences nucléotidiques, les tailles d'amplicon, le numéro d'accession et l'efficacité PCR des amorces RG sont décrits dans le tableau 1.

2.5. Extraction d'ARN, synthèse d'ADNc et qRT-PCR

L'ARN total a été extrait des MSC à l'aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant avec une étape d'élimination de l'ADN génomique résiduel par traitement à la DNase sans RNase (Qiagen). La concentration et la pureté de l'échantillon d'ARN ont été mesurées en évaluant le rapport A260/A280 à l'aide d'un spectrophotomètre (NanoDrop 1000, Thermo Fisher Scientific). L'ADNc du premier brin a été synthétisé à partir de 1 ??g d'extrait d'ARN total en utilisant Omniscript Reverse Transcription Kit (Qiagen) à 37°C pendant 1 h. Pour l'amplification PCR, le mélange réactionnel contenant le mélange Rotor-Gene 2X SYBR Green (Qiagen), 2 ??l ADNc et 400 nM de chaque amorce directe et inverse ont été exécutés dans une machine Rotor Gene Q qRT-PCR (Qiagen) après le programme de pré-dénaturation à 95°C pendant 10 min, 45 cycles à 95°C pendant 10 s , 60°C pendant 6 s, et 72°C pendant 4 s, et une courbe de fusion de 60°C à 95°C de 1°C/s et refroidissement à 40°C pendant 30 s. Rotor-Gene Q Series Software (Qiagen) was used for the analysis of amplification curves, melting curves, and cycle threshold values (Ct values). All amplicons from qRT-PCR were checked by gel electrophoresis to verify their expected product size and confirmed the absence of nonspecific amplification.

2.6. Analysis of Stable Reference Gene Expression

The experimental groups for analyzing stable RGs throughout long-term culture expansion of MSCs under defined culture conditions were allocated into BM-MSCs (Group 1), UCB-MSCs, (Group 2), and both BM-MSCs and UCB-MSCs (Group 3). The Ct values of each RG were assessed via commonly used RG validation programs: geNorm and NormFinder. The geNorm program measures the gene expression stability (M value), where a gene calculated as the highest M value is excluded from the pool of tested genes as the least stable RG then the new M values are continuously generated until the last two genes with the lowest M values are left as the most stable RGs. In addition, the GeNorm suggests the normalization factors (NF) for an optimal number of RGs (

) with pairwise variation (Vn/n+1) estimated by continuous calculation depending on adding other genes sequentially from 2 genes with the lowest M value [23]. In the present study, correlations between and NF for three most stable reference genes (NF3) were analyzed by Pearson’s correlation using PASW Statistics 18 (SPSS inc., NY, USA) to reduce excessive number of RGs during normalization. Using NormFinder the stability and standard errors of the transcriptional variation of the RGs were calculated via analysis of variance (ANOVA)-based model to evaluate both the single most stable RG showing the lowest value and the best combination of two RGs [24].

2.7. The Use of Different RGs in the Normalization of GOI

The effect of stability of RGs in the normalization of GOI was evaluated by using different RGs including the most stable RGs in the present study, and the traditional RGs, which are verified as less stable to calculate the relative gene expression of OCT4 in E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs (Table 1). The qRT-PCR for evaluating OCT4 expression was carried out as described above. The Ct values of OCT4 were then normalized to five RGs (ACTB, GAPDH, HPRT1, PPIA, and YWHAZ) using RotorGene Q Series Software (Qiagen).

2.8. Analyses statistiques

The one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test was performed to determine the significant difference among the groups using PASW Statistics 18 (SPSS Inc.). Differences were considered significant when P < 0.05 and all data were represented as mean ± SD.

3. Résultats

3.1. Comparative Characterization of Long-Term Expanded BM-MSCs and UCB-MSCs

The BM-MSCs showed a gradual change in their fibroblastic morphology upon culture expansion however, UCB-MSCs maintained their fibroblastic morphology until L-UCB-MSCs under defined culture conditions (Figure 1(a)). Both E-BM-MSCs and E-UCB-MSCs were strongly positive for MSC-specific surface markers expression such as CD44, CD105, and vimentin while negative for hematopoietic stem cell markers (CD34 and CD45), and the expression patterns were maintained throughout the long-term culture expansion period. The expression of CD105 in L-BM-MSCs was reduced although not significant (P > 0.05) (Figure 1(b) & Supplementary Figures 1 and 2). Further, UCB-MSCs showed differentiation capacity towards mesenchymal lineages such as osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes from E-UCB-MSCs to L-UCB-MSCs, whereas, BM-MSCs lost their differentiation potential during long-term expansion as observed in M-BM-MSCs and L-BM-MSCs (Figure 1(c)). Similar to differentiation capacity, proliferative ability and SA-??-gal in UCB-MSCs were not affected by long-term expansion when compared to that in long-term expanded BM-MSCs (M-BM-MSCs and L-BM-MSCs), which displayed weaker proliferative ability and increased SA-??-gal activity than E-BM-MSCs (Figures 1(d) and 1(e)). Overall, both BM-MSCs and UCB-MSCs maintained their stemness during early passage, and that the long-term expansion of BM-MSCs to later passages under defined culture conditions resulted in alteration of their characteristics and loss of stemness.

P < 0.05 vs E-BM-MSCs. (e) Senescence-associated ??-galactosidase (SA-??-gal) activity in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs. Absorbance was measured at 405 nm. The data were presented as mean ± SD, P < 0.05 vs E-BM-MSCs. E-/M-/L-BM-MSCs, bone marrow-derived mesenchymal stem cells at early passage (passage 2-4)/middle passage (passage 10-12)/late passage (passage 18-20) E-/M-/L-UCB-MSCs, umbilical cord blood mesenchymal stem cell at early passage (passage 2-4)/middle passage (passage 10-12)/late passage (passage 18-20).

3.2. Evaluation of Primer Specificity, Amplicon Size, and Ct Values of Selected RGs

The standard curves were generated to check primer efficiency, which resulted in 0.990-0.999 correlation coefficient ( ) and 0.93-1.03 PCR efficiencies (E), indicating that the selected RGs in the present study for qRT-PCR are acceptable and valid for the quantification of transcripts and further experimentation (Table 1). Each RG amplified showed a high peak of a single product without any considerable nonspecific amplification in melting curve analysis. In addition, all amplicons were evaluated for primer specificity with expected product size by gel electrophoresis (Figure 2(a) and Table 1). When 10 RGs were evaluated for possible change in their mRNA levels during long-term expansion of both BM-MSCs and UCB-MSCs by qRT-PCR, a significant difference in Ct values was noted in some RGs. The HPRT1 was the only RG that showed different Ct values between E-UCB-MSCs and L-UCB-MSCs. However, many RGs including 18S, B2M, EEF1A1, GAPDH, RPLP0, and TBP showed significantly (P < 0.05) different Ct values during long-term expansion of BM-MSCs (Figure 2(b)). These results indicate that the expression level of RGs can be affected by long-term expansion of cells, especially in BM-MSCs.

3.3. Analysis of the Most Stable Reference Gene by geNorm

The Ct values of long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs were analyzed by geNorm to obtain M value and stable ranking of 10 RGs via gradual stepwise exclusion of the least-stable RGs. In the present study, all M values of each gene were found to be less than 1.5 indicating that all genes were reliable to use as RGs. The geNorm software suggested that YWHAZ, HPRT1, and PPIA were the 3 most stable RGs in all groups of MSCs except the traditional RGs such as GAPDH and ACTB which were found to be unstable or less stable (Figure 3(a)). Furthermore, pairwise variations by geNorm proposed that in Group 1, Group 2, or Group 3 was

, and , respectively (Figure 3(b)). Since it is inefficient to use 4-7 RGs in the normalization of GOI, the correlation between and

was assessed to remove the excessive usage of RGs where all groups had high correlation (r > 0.9, Pearson) between and (Figure 3(c)).

3.4. Analysis of the Most Stable Reference Gene by NormFinder

Using NormFinder analysis program, the PPIA or YWHAZ were determined as the most stable reference genes in Group 1 or Group 2 and 3, respectively. Furthermore, when intergroup variations were considered, the best combination of two genes from the pool of 10 RGs was YWHAZ with HPRT, or PPIA with HPRT in Group 1 or Group 2 and 3, respectively (Figure 4). In consistent with the results obtained from geNorm, NormFinder showed that YWHAZ, HPRT1, and PPIA were the most stable RGs during long-term expansion of BM-MSCs and UCB-MSCs while traditional RGs were less stably expressed. A slight difference obtained in the rankings of 10 RGs between geNorm and NormFinder may possibly due to the different algorithms used.

3.5. Use of Most Stable Reference Genes for Normalization of GOI

Based on the results obtained in Figures 1 and 2, it is likely that long-term expansion under defined culture conditions has affected the characteristics of BM-MSCs in terms of their differentiation and proliferative ability, degree of cellular senescence, and RG expression levels. Therefore, to verify the influence of RGs on normalization of gene of interest, the expression of OCT4, a key pluripotency-related gene, was normalized against the three most stable RGs (PPIA, HPRT1, and YWHAZ) determined in the present study and the less stable traditional RGs (ACTB and GAPDH) in E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs. As a result, OCT4 expression in L-BM-MSCs was significantly (P < 0.05) decreased when compare to that in E-BM-MSCs when PPIA, HPRT1, YWHAZ, and ACTB were used for normalization. However, the traditional RG GAPDH showed no significant difference in OCT4 expression between E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs (Figure 5).

4. Discussion

As MSCs are currently promising regimens for regenerative medicine and immunomodulatory agents, the use of suitable RGs is indispensable to assess the accurate and reliable gene expression data [10, 11, 21]. In addition, since long-term expansion of MSCs under defined culture conditions and the effect of such in vitro environments on cells must be studied prior to their application. Hence, the expression stability of 10 commonly used RGs was evaluated in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs under defined culture conditions through widely used RG validation programs (geNorm and NormFinder). Both programs suggested that PPIA, HPRT1, and YWHAZ are the three most stable RGs regardless of in vitro culture expansion period.

The long-term expanded MSCs display limited proliferation ability similar to somatic cells may be due to the replicative senescence [25–27]. The senescent MSCs display not only altered proliferation ability but also morphological changes, loss of differentiation capacity, increased expression of SA-??-gal, elevated oxidative stress, epigenetic modifications, telomere shortening, DNA damage, and change in genes expression profile [27–32]. In the present study, BM-MSCs showed enlarged and irregular morphologies, gradual loss in trilineage differentiation capacity and proliferative ability, and increased senescence-associated SA-??-gal marker expression, while UCB-MSCs maintained their phenotypes through early passages to late passages (Figure 1). Although, the decreased expression of CD105 during long-term expansion of BM-MSCs was not significant, this slight decrease in the expression may be due to the unknown consequences under serum free culture conditions [33]. In addition, the expression of several RGs in BM-MSCs was affected by long-term expansion. However, the HPRT1 was the only gene affected in the long-term expanded UCB-MSCs under present experimental conditions. Since HPRT1 known to play a central role in purine salvage pathway, cell cycle, and proliferation mechanisms, its change in expression in L-UCB-MSCs may possibly be due to a compensatory mechanism to maintain proliferative ability under defined culture conditions (Figures 1(d) and 2(b)) [34, 35]. Overall, the long-term expansion of MSCs resulted in the alteration of cellular characteristics as well as the expression of RGs.

The validation of most stable RGs under each experimental condition is an essential step to obtain accurate and reliable results by qRT-PCR because there is no single RG that is universally stable in its expression under all defined culture conditions. The present study also demonstrated that the expression level of RGs could be affected by experimental conditions as evident in Figure 2(b). For instance, although ACTB and GAPDH are the basic cell survival factors, their expression level was found to change as high as seventeen times based on culture conditions and culture duration [5, 6, 20, 36]. Therefore, the selection of nonvalidated or unstable RGs during normalization of GOI may lead to inconsistent or misleading results [11, 37]. The incorrect selection of RGs drastically affects the results [4, 11, 22, 38]. When the expression of lineage-specific markers in differentiated MSCs toward adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes was normalized against the most stable RGs (RPLP0 and EEF1A1 for osteogenesis TBP and YWHAZ for adipogenesis and chondrogenesis) and the least stable RG (EEF1A1 for adipogenesis B2M for osteogenesis and chondrogenesis), inconsistent results of the relative expression of lineage-specific markers were significantly (p < 0.0001) identified. Especially, normalization against the least stable RGs in differentiated MSCs toward osteoblasts and chondrocytes resulted in less fold change in the expression compared to that when using the most stable RGs [4].. In addition, the relative gene expression levels of chondrogenic markers or OCT4 from chondrogenesis-induced ATDC5 cells (progenitor cells for chondroblasts) or different types of porcine blastocysts were found to be varied depending on the use of RGs, respectively [22, 38]. The present study also demonstrated an inconsistence in results obtained between stable RGs (PPIA, HPRT1 and YWHAZ) and the traditional RGs (ACTB and GAPDH) during long-term expansion of MSCs under defined culture conditions. Considering the occurrence of loss of stemness during long-term expansion of BM-MSCs, the expression of OCT4 in L-BM-MSCs was reduced when compared to E-BM-MSCs when three most stable RGs verified in the present study were used however, no significant difference in the expression of OCT4 was noted in BM-MSCs irrespective of culture period when GAPDH was used for normalization (Figure 5). Therefore, these results indicate that the validation and use of stable RGs under each experimental condition are critical for accurate analysis of qRT-PCR in order to avoid the false conclusions resulting from the use of invalidated RGs.

The validation of Ct values obtained by qRT-PCR using well-established algorithms such as geNorm, NormFinder, and BestKeeper is necessary to investigate the stability of RGs. Recently, several studies have evaluated the most stable RGs in human MSCs or progenitor cells [4–6, 20, 39, 40]. The importin 8 (IPO8), cancer susceptibility candidate 3 (CASC3), and TBP were recommended as RGs for studies on osteoarthritis patient-derived BM-MSCs [39]. Further, it has been demonstrated that the expression of TBP and YWHAZ is found to be stable in BM-MSCs and adipose tissue-derived MSCs (AT-MSCs) regardless of treatments such as supplementation of vascular endothelial growth factor (VEGF) to potentially enhance the properties of MSCs [40]. Considering that the studies involving comparative characterization of various source derived MSCs including an evaluation of stable RGs under varied differentiation status are prerequisite to define the most appropriate cell source for clinical applications. The expression of RPL13A in AT-MSCs and Wharton’s jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) and HPRT1 in BM-MSCs has been validated as stable and the expression of TBP, YWHAZ, glucuronidase beta (GUSB), and RPL subtypes has been identified as most stable for UCB-MSCs, BM-MSCs, and AT-MSCs with or without induction of differentiation [4, 5]. Further, PPIA, B2M and RPL13A are recommended to use as RGs for BM-MSCs and fetal tissue-derived MSCs (FT-MSCs) [6]. In general, RPL subtypes are found to be more stable with minor inconsistency among donors when compared to other RGs [20]. The different experimental conditions such as cell source, donor, treatment, differentiation induction, and cell expansion may have profound effect on the stability of RGs. Therefore, it is important to verify the most stable RGs under each experimental condition before using for further studies. The present study recommends the use of PPIA, HPRT1, and YWHAZ for normalization of GOI in qRT-PCR experiments to get accurate and reliable results as determined by geNorm and NormFinder analysis for long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs [Figures 3 and 4].

Previously, several RGs such as ACTB and GAPDH were traditionally used for normalization as they were thought to be constantly expressed in different cell lines and conditions [5]. However, these traditional RGs have been reported to be unstable in many studies with MSCs [4, 5, 20, 39, 41]. The analysis of higher maximum fold change (MFC) of ACTB among other RGs in osteogenesis-induced BM-MSCs indicated the expression of ACTB was associated with morphological changes of differentiated MSCs and found to be unstable during osteogenesis [41]. In addition, the lower stability of ACTB among pool of candidate RGs was demonstrated in AT-MSCs, BM-MSCs, WJ-MSCs, and UCB-MSCs under different experimental conditions [4, 5, 20, 39]. Similar to ACTB, the expression of another RG GAPDH was also found to be variable or less stable in AT-MSCs and BM-MSCs [5, 42, 43]. In consistency with these earlier findings, the present study also demonstrated that ACTB and GAPDH were less stable in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs and were not always successful in all normalization data. Both geNorm and NormFinder analysis found that the stability rankings of ACTB and GAPDH were placed in fifth to ninth among the pool of 10 RGs. In addition, GAPDH led to inconsistent or misleading results during normalization of OCT4 [Figure 5]. These results indicated that both ACTB and GAPDH are not suitable RGs with regard to gene expression analysis in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs under defined culture conditions and, therefore, highlighting the importance of validation of RGs.

In conclusion, the present study demonstrated that the three RGs, PPIA, HPRT1, and YWHAZ among the pool of 10 RGs are more suitable for normalizing the expression of GOI and that the traditional RGs such as ACTB and GAPDH are identified as less stable under current experimental conditions. To our knowledge, this is the first kind of its study to evaluate the stability of the expression of RGs under multifactorial conditions with respect to cell source, long-term expansion until passage 20, and defined media culture conditions.

Data Availability

All the data related to the current manuscript can be made available upon request whenever needed.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflits d'intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

This research was supported by a grant from Ministry of Food and Drug safety (12182MFDS666 2012), Republic of Korea.

Matériaux supplémentaires

Supplementary 1. Supplementary Figure 1: Cell surface marker analysis of MSC-positive markers (CD44, CD105, and Vimentin) and negative markers (CD34 and CD45) in long-term expanded BM-MSCs. Here E-BM, M-BM, and L-BM represent the early, middle, and late bone marrow MSCs.

Supplementary 2. Supplementary Figure 2: Cell surface marker analysis of MSC-positive markers (CD44, CD105, and Vimentin) and negative markers (CD34 and CD45) in long-term expanded UCB-MSCs. Here E-UCB, M-UCB, and L-UCB represent the early, middle, and late umbilical cord blood MSCs.

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Droits d'auteur

Copyright © 2019 Ryoung-Hoon Jeon et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


Informations sur l'auteur

Affiliations

School of Veterinary Science, The University of Queensland, Gatton, QLD, Australia

N. Sarker, J. Meers, H. Owen, J. M. Seddon & G. Simmons

School of Animal and Veterinary Sciences, The University of Adelaide, Roseworthy, SA, Australia

J. Fabijan, F. Hemmatzadeh, N. Speight, D. Trott & L. Woolford

School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD, United Kingdom

Advanced Data Analysis Centre (ADAC), University of Nottingham, Sutton Bonington, United Kingdom


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