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Stabilité de la Taq Polymerase à haute température

Stabilité de la Taq Polymerase à haute température


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On m'a posé une question sur ce qui est si spécial avec la Taq Polymerase qui la rend assez stable à haute température bien que son fonctionnement soit le même que celui des autres ADN polymérases comme celle des mésophiles.

Je pense juste que c'est l'adaptation de cette bactérie particulière dans cet environnement à haute température. Mais je veux savoir s'il y a une raison solide à cette stabilité.


Eh bien, la raison évolutive est celle que vous avez évoquée : la thermostabilité du Taq a permis à sa bactérie de coloniser des environnements à haute température. Cela, cependant, ne dit rien sur les raisons moléculaires de cette différence.

J'ai trouvé cette très bonne réponse sur Quora. La fin du post a plusieurs références pour ses revendications.

Pour faire court, la stabilité d'un état replié de protéines dépend de la différence d'énergie libre $Delta G$ entre les états plié et déplié. Cependant, $Delta G = Delta H - T Delta S$, ce qui signifie que la différence d'énergie libre peut provenir soit d'une plus grande différence d'enthalpie (par exemple, ponts salins, liaisons hydrogène, interactions hydrophobes et autres à l'état replié) soit d'une plus petite différence d'entropie (par exemple, un faible nombre de acides aminés "non rigides" comme la glycine, ou une forte libération d'eau du pliage).

Alors que l'enthalpie est souvent la raison de la stabilité du repliement, il semble que pour la Taq polymérase, la différence réside en fait dans une différence inhabituellement faible d'entropie entre les deux états.

Edit : voici une des meilleures références du post. Ouvrez le lien ci-dessus pour en savoir plus. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24174290


Purification des ADN polymérases thermostables

Les polymérases thermostables sont bien sûr des catalyseurs clés de la biologie moléculaire, en raison de leur utilité dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Aujourd'hui, je vais vous montrer le processus par lequel ces enzymes importantes sont isolées. Vous apprendrez à fabriquer votre propre polymérase Taq à l'aide du vecteur d'expression open source pOpenTaq, ainsi qu'à comprendre les degrés de pureté des polymérases commerciales proposées par Gene And Cell Technologies. Les principes décrits dans cet article de blog devraient s'appliquer à toute polymérase d'acide nucléique thermostable.

La polymérase Taq peut être exprimée sous la forme pOpenTaq, un plasmide d'expression de polymérase taq open source. pOpenTaq doit être transformé dans une souche E. coli BL21 et induit avec 1 mM d'IPTG en utilisant des protocoles standard. L'expression pendant la nuit maximisera le rendement. 100% de la protéine sera exprimée sous forme soluble à 37°C.

Notre stratégie de purification va être :


Stabilité de la Taq Polymerase à haute température - Biologie

Le composant du master mix disponible dans le commerce le plus sensible aux conditions défavorables est une polymérase. Les master mix disponibles dans le commerce pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont généralement recommandés pour un stockage à -20°C, sinon ils peuvent perdre leur activité.

L'objectif de l'expérience était de vérifier si le stockage des mélanges dans des conditions défavorables et extrêmes peut influencer la qualité d'un produit PCR. Dans la deuxième phase de la recherche, il s'agissait d'indiquer si des réactifs PCR inactifs ayant perdu leur activité, pouvaient retrouver leurs propriétés enzymatiques.

Matériel et méthodes

Cinq master mix différents disponibles dans le commerce ont été incubés dans des conditions défavorables. Après la PCR, une électrophorèse a été réalisée et le produit obtenu était la preuve d'une réaction PCR appropriée.

Résultats et discussion

La dégradation totale des mélanges a été causée par leur incubation à température ambiante pendant 28 jours et leur incubation à 100°C pendant 60 minutes. L'ajout de polymérases aux mélanges dégradés (incubation à température ambiante pendant 28 jours) a entraîné une régénération de l'ensemble des cinq mélanges. Dans le cas des polymérases incubées à 100°C pendant 60 minutes, la régénération n'a été efficace que dans deux des cinq mélanges.

Conclusion

Nos recherches confirment que le master mix PCR se caractérise par une résistance élevée à des conditions variées et, dans certains cas, peut être réparé après dégradation.


Thermostabilité de l'ADN polymérase

L'ADN est une molécule dynamique dont la structure est stabilisée par un grand nombre d'interactions faibles. La stabilité de la double hélice d'ADN dépend de divers facteurs, notamment la séquence d'ADN, le pH, la force ionique, les solvants et la température. En particulier, lorsque la température augmente, les interactions faibles sont séquentiellement interrompues, entraînant d'abord une dénaturation localisée des séquences internes terminales et sélectionnées, et aboutissant finalement à une séparation complète des brins d'ADN. Le degré auquel cette déstabilisation est souhaitée ou tolérée dépend de l'application.

Par exemple, les procédures de clonage, telles que le polissage final, sont maximisées lorsque les extrémités sont stabilisées, suggérant l'utilisation d'une polymérase dérivée d'un organisme mésophile. La synthèse d'ADNc du second brin et la translation de coupure sont d'autres applications qui utilisent traditionnellement des enzymes mésophiles. Ces enzymes sont actives au maximum à des températures de 25&ndash40°C et conservent également une activité significative à des températures plus basses. Généralement, ils peuvent être inactivés par la chaleur et fonctionner dans les mêmes tampons que ceux utilisés par les endonucléases de restriction et les ligases, évitant ainsi la nécessité d'une purification intermédiaire de l'ADN.

Une variété d'autres applications de biologie moléculaire, telles que la PCR, nécessitent des températures élevées pour dénaturer l'ADN avant l'annelage de l'amorce ou pendant la polymérisation pour réduire la structure secondaire, réduisant ainsi la pause de la polymérase. ADN polymérases archées, telles que Vent® (NEB #M0254) et 9°Nm&trade (NEB #M0260) sont dérivés d'hyperthermophiles et sont extrêmement résistants à l'inactivation thermique, même à 100°C, et présentent une activité polymérase maximale à 75&ndash85°C. Les thermophiles bactériens ont produit des enzymes telles que Taq L'ADN polymérase, qui est active à des températures similaires, mais n'est pas aussi stable à 95°C que certains de ses homologues archéens.

Vent® est une marque déposée de New England Biolabs, Inc.
9°Nm&trade est une marque de commerce de New England Biolabs, inc.


Faits Taq

Lorsque la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été décrite pour la première fois, le fragment de Klenow dérivé de l'ADN polymérase I d'Escherichia coli était l'enzyme primordiale pour l'extension de séquence. En raison de son manque de stabilité à haute température, il doit être renouvelé avant chaque cycle. Lors de la découverte de bactéries thermophiles qui se développent à des températures supérieures à 45 °C, des polymérases thermostables qui fonctionnent à des températures plus élevées ont été étudiées dans le but d'éliminer le besoin de reconstituer l'enzyme après chaque cycle de dénaturation.

Taq L'ADN polymérase a été isolée à l'origine de la bactérie thermophile du groupe Deinococcus-Thermus située près du bassin inférieur du geyser du parc national de Yellowstone par Thomas D. Brock et Hudson Freeze, en 1969. Cette bactérie florissante a été nommée Thermus aquatique (T. aquaticus). Plusieurs enzymes ont été isolées de T. aquaticus, dont la plus connue est Taq ADN polymérase (Taq). Taq peut être isolé soit à partir de sa source d'origine, soit à partir de son gène cloné exprimé dans E. coli. Bien que de nombreuses similitudes de séquence et de structure existent entre l'ADN polymérase I d'E. coli et Taq, les différences dans la fonctionnalité, le caractère et les dépendances enzymatiques font Taq la polymérase idéale pour une utilisation dans l'analyse de l'expression génique basée sur la qPCR, à l'exception des mesures sensibles de certains gènes bactériens. Cette mise en garde est expliquée plus loin.

Caractérisation de Thermus aquatique ADN polymérase

Fonctionnalité : Utilisation de l'activité exonucléase inhérente 5' à 3' de Taq, les chercheurs sont capables de réaliser simultanément une amplification PCR et une libération de signal à partir d'une sonde fluorogène spécifique à la cible. L'activité exonucléase 5' à 3' de Taq clive l'extrémité 5' d'une sonde oligo hybridée pour libérer à la fois les mono- et les oligonucléotides. La sonde est hydrolysée en même temps que la réplication du brin de sorte que le signal fluorescent accumulé est en corrélation avec l'amplification.

Taille et activité : Bien que des poids variables aient été signalés, la taille approximative des Taq est de 94 kd, avec l'activité d'une ADN polymérase localisée à l'extrémité C-terminale et une activité exonucléase 5' à 3' localisée à l'extrémité N-terminale. À ce jour, aucune activité d'exonucléase 3' à 5' n'a été observée comme dans d'autres polymérases, où la base mésappariée à l'extrémité 3' est excisée au cours d'un processus de « relecture ». Le taux d'erreur a été signalé comme étant aussi bas que 10 -5 pour les erreurs de substitution de base et 10 -6 pour les erreurs de décalage de trame.

Dépendance à la température : Les thermophiles sont répandus dans la nature et certaines espèces procaryotes prospèrent à des températures supérieures à 45 ° C. La dépendance à la température de Taq le rend optimal à 80°C, où son activité catalytique est plus de dix fois supérieure à celle typiquement observée à 37°C. Il est possible que la diminution d'activité au-dessus de 80°C soit en réalité due à la dénaturation de l'ADN double brin à ces températures.

Dépendances des cations monovalents et divalents : les concentrations de sel requises pour des performances optimales sont considérées comme étant de 40 mM de NaCl et 60 mM de KCl. Des concentrations supérieures à 100 mM pour ces cations monovalents sont prohibitives pour l'activité catalytique. Ceci contraste avec l'insensibilité au sel de l'enzyme polymérase I de E. coli. En outre, Taq peut dépendre — comme d'autres polymérases — de la présence de cations divalents, à savoir MgCl2 ou MnCl2, avec des concentrations optimales en fonction de la conception expérimentale. Des concentrations plus élevées de manganèse peuvent conduire à un taux d'erreur accru d'incorporation de nucléosides. L'activité avec d'autres ions divalents peut être significativement diminuée ou absente, comme c'est le cas avec plus de 0,25 mM de Ca+2. Taq nécessite la présence des quatre espèces de désoxyribonucléoside triphosphates et d'ADN pour une activité catalytique optimale.

Dépendance du pH : Le pH optimal pour l'enzyme se situe dans la plage de 7 à 8 unités de pH à 80 °C et variera en fonction du système tampon utilisé. Dans un tampon Tris-chlorhydrate 25 mM par exemple, l'optimum d'alcalinité est de 7,8 unités de pH.

La grande mise en garde : les invités non invités

À l'occasion, cloné Taq la polymérase s'est avérée avoir un ADN bactérien contaminant qui est peut-être transféré du système de vecteur d'expression ou d'autres sources utilisées pendant la fabrication de la polymérase. Cette contamination résiduelle peut limiter l'utilisation de clones Taq dans la détection d'ADN bactérien dilué dans certains échantillons. La contamination à l'état de traces peut être impossible à éliminer complètement, et en effet, certaines estimations du nombre de contaminations dans les Taq disponibles dans le commerce ont revendiqué jusqu'à 1000 équivalents génomiques d'ADN bactérien par unité d'enzyme.

Plusieurs méthodes pour éliminer l'ADN bactérien de Taq polymérase ont été testées et apparaissent dans la littérature. Des méthodes telles que l'exposition à la lumière ultraviolette inférieure à 320 nm (UVB ou UVC) ont pour effet de rendre l'ADN résistant à l'amplification, mais elles affectent également l'intégrité du Taq polymérase, réduisant l'efficacité de l'incorporation des nucléosides. Ultra-filtration du Taq la polymérase, bien que souvent capable d'éliminer les faux positifs, le fait avec l'effet indésirable de diminuer la sensibilité du dosage. Le traitement au 8-méthoxypsoralène activé par UVA pour intercaler l'ADN contaminant dans l'ADN double brin est difficile à optimiser et inhibe la réaction PCR. En plus des méthodes ci-dessus, les endonucléases de restriction et le traitement à la DNase I pour digérer l'ADN dans Taq les préparations peuvent introduire des contaminants ou devenir les contaminants eux-mêmes.

Une méthodologie récente en question est la dilution en série de la Taq polymérase (jusqu'à 32 fois) pour diluer efficacement l'ADN bactérien contaminant tout en maintenant Taq activité et sensibilité. Cette technique a pour conséquence un plateau de réaction à des nombres de cycles inférieurs. Cet effet génère un signal plus faible dans l'analyse du point final, avec des conséquences minimes sur la quantification basée sur un seuil pendant la phase exponentielle.


Enzyme : stabilité Taq - (21 novembre 2011 )

Je m'interroge sur la « mise en garde stricte » concernant le stockage des enzymes à -20 °C. Les fabricants disent souvent que nous devons conserver les enzymes (par exemple Taq) à la réception à -20 °C. Pourtant, cette enzyme est utilisée en PCR à 95°C pendant au moins 2 h et reste active après des cycles alternatifs de 95/55°C°. Cela signifie que sa stabilité est très élevée.
De plus, si nous regardons le liquide des lave-vaisselle, toutes les enzymes sont conservées à température ambiante et restent actives!
Alors, ma question, mon patron a-t-il raison de paniquer quand j'oublie le Taq sur banc pendant quelques minutes ?

La taq et de nombreuses autres enzymes se dégradent assez rapidement à température ambiante, quelques minutes suffisent probablement, mais certainement pas des heures. A 95 deg taq se dégrade assez rapidement, je pense qu'il n'est stable que quelques minutes. Les enzymes dans les lave-vaisselle, etc. sont toutes stabilisées ou sont des formes résistantes à la dégradation. Si vous souhaitez étudier des enzymes stables, la RNase est un bon point de départ.

Afin de ne pas le laisser à température ambiante, il est bon de le conserver sur de la glace en tout temps.

Merci pour votre réponse.
Vous dites que Taq est stable pendant quelques minutes, comment cela se passe-t-il dans une analyse PCR qui dure

1h30 ? S'il n'est stable que quelques minutes, cela signifie que l'ADN ne sera pas amplifié efficacement!
Pendant l'exécution de la PCR, Taq est actif pour amplifier l'ADN s'il est dégradé, il n'y aura pas d'ADN amplifié, ou seulement en très petite quantité!

Taq d'Invitrogen a ces temps de demi-vie :

5 minutes à 97,5°C
40 minutes à 95°C
120 minutes à 92,5°C

Je suppose que les Taqs d'autres sociétés ont des valeurs similaires. Par conséquent, des températures plus élevées ne sont pas ce problème pendant une courte période. Mais de toute façon, ce sont des minutes, et je ne le conserverais jamais à des températures plus élevées ou dans un réfrigérateur, car les délais sont alors des jours, des semaines ou des mois. Bye -20 degrés vous évitez une dégradation lente et progressive, mais gardez une concentration plus ou moins constante en enzyme active.

Taq la polymérase est assez stable à température ambiante pendant six mois à condition qu'elle ne soit pas ouverte! Si elle est ouverte à plusieurs reprises, vous avez de très bonnes chances de cultiver une belle contamination bactérienne ou fongique en suspension dans l'air dans le tampon de stockage à 50% de glycérol.
(Duncan Clark, DNAmp Ltd. (Fabricant sous licence d'enzymes PCR) le 03.08.96 à http://www.bio.net/bionet/mm/methods/1994-. ber/019005.html)

J'ai oublié Taq sur le banc pendant la nuit.
Cela fonctionnait encore.

Il est préférable de le garder à -20 °C, mais si une fois que vous l'avez oublié, vous n'avez pas besoin de le jeter. essayez avec un ou deux échantillons pour voir si cela fonctionne.
Si j'étais votre patron, je ne paniquerais pas, mais je vous crierais quand même de ne pas oublier l'enzyme sur le banc.


Quelles sont les exigences pour une ADN polymérase utilisée en PCR ?

Les principales exigences pour une ADN polymérase utilisée en PCR sont une activité optimale à des températures d'environ 75 ° C et la capacité de conserver cette activité après une incubation prolongée à des températures encore plus élevées.

Explication:

La PCR nécessite une enzyme ADN polymérase qui fabrique de nouveaux brins d'ADN, en utilisant les brins existants comme matrices.

L'ADN polymérase généralement utilisée en PCR est appelée Taq polymérase et est isolée de la bactérie tolérante à la chaleur Thermis aquaticus. T. aquatique vit dans les sources chaudes et les sources hydrothermales. Son ADN polymérase est très stable à la chaleur et est plus active autour de 70 ° C. Cette stabilité thermique rend la Taq polymérase idéale pour la PCR, car une température élevée est utilisée à plusieurs reprises dans la PCR pour dénaturer l'ADN matrice ou séparer ses brins.
L'ADN polymérase Pfu de Pyrococcus furiosus est également utilisée en raison de sa plus grande fidélité lors de la copie d'ADN.


Pfu Polymérases

L'une des principales polymérases vers lesquelles les gens se tournent lorsqu'ils ont besoin d'une haute fidélité est Pfu (Pyrococcus furiosus) ADN polymérase. Ces polymérases sont isolées de Pyrococcus furiosus, une espèce d'archaea extrêmophile qui prospère sous des températures extrêmement élevées. Cette polymérase est idéale pour cloner individuellement des produits pour des expériences de séquençage, de mutagenèse ou d'expression. contrairement à Taq ADN polymérase, Pfu L'ADN polymérase possède une activité de relecture des exonucléases de 3 à 5 8242, ce qui signifie qu'elle se fraie un chemin le long de l'ADN de l'extrémité 5 à l'extrémité 3 et corrige les erreurs de mauvaise incorporation des nucléotides. Cela signifie que Pfu Les fragments PCR générés par l'ADN polymérase auront moins d'erreurs que Taq-inserts PCR générés, avec un taux d'erreur publié d'environ 1,3 × 10 ?6 erreurs par paire de bases et par duplication. L'inconvénient de Pfu est sa vitesse qui est plus lente que celle de Taq. Combinant Pfu et Taq vous offre la meilleure option car vous obtenez la vitesse de Taq avec la fidélité de Pfu.

Surmonter l'empoisonnement au dUTP avec Pfu

Pfu souffre également d'un empoisonnement au dUTP et on y remédie avec une variante appelée Pfu Turbo (Pfu et combinaison de facteurs ArchaeMaxx). L'empoisonnement au dUTP est causé par l'accumulation de dUTP par la désamination du dCTP et entraîne une diminution de la relecture par votre enzyme. ArchaeMaxx est un dUTPase qui convertit le dUTP toxique en dUMP inoffensif (un nom plutôt merveilleux !) +iPP

Enzymes modifiées

Afin d'augmenter encore la fidélité et également d'améliorer la vitesse d'allongement, de nouvelles formes de polymérases ont été créées. Beaucoup de ces enzymes de conception sont basées sur ou sont des formes modifiées de Pfu ADN polymérase. Les modifications ont permis d'augmenter la vitesse de l'enzyme ainsi que la capacité de relecture, donc si vous avez besoin d'enzymes rapides et de très haute fidélité, c'est ce que vous recherchiez. Les exemples incluent la polymérase Phusion de NEB, la polymérase d'ADN One-Fusion de Gene-On et la PfuUltra II Fusion HS ADN polymérase.


Stabilisation de Taq ADN polymérase à haute température par voies de repliement des protéines d'un archéon hyperthermophile, Pyrococcus furiosus

Pyrococcus furiosus, un archéon hyperthermophile se développant de manière optimale à 100°C, code trois protéines chaperons, une petite protéine de choc thermique (sHsp), une préfoldine (Pfd) et une chaperonine (Cpn). Dans cette étude, nous rapportons que les chaperons passifs sHsp et Pfd de P. furiosus peut stimuler l'activité de repliement des protéines du Cpn ATP-dépendant du même hyperthermophile. La thermo-stabilité de Taq polymérase a été significativement améliorée par des combinaisons de P. furiosus chaperons, montrant une activité continue de repliement des protéines à des températures élevées et pendant le cycle thermique. Sur la base de ces résultats, nous proposons que l'appareil de repliement des protéines dans l'archéon hyperthermophile, P. furiosus peut être utilisé pour améliorer la durabilité et la rentabilité des biocatalyseurs à haute température. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.


Stabilité de la Taq Polymerase à haute température - Biologie

MB016-HYT : ADN polymérase Taq à haut rendement

* Processivité robuste. Des fragments d'ADN génomique humain jusqu'à 10 kb et lamda de 15 kb ont été testés pour l'amplification.
* Haute pureté. >98% homogène de la Taq ADN polymérase par électrophorèse sur gel SDS. Aucune contamination détectée dans les réactions de test PCR standard.
* Résultats reproductibles. Aucun changement d'activité visible après le stockage de l'ADN polymérase Taq à haut rendement à température ambiante pendant 3 mois pour amplifier un gène à copie unique du génome humain avec une grande efficacité.
* Relecture avec activité exonucléase 5&prime.

MB038-OS25 : Kit RT-PCR en une étape

Le kit RT-PCR en une étape simplifie l'assemblage de la synthèse d'ADNc du premier brin et de la réaction PCR dans un seul tube et offre des avantages en termes de gain de temps, de commodité, de cohérence et de risque minimal de contamination et d'erreurs de pipetage.

MB038-TS25 : Kit RT-PCR en deux étapes

Le kit RT-PCR en deux étapes contient tous les composants nécessaires pour effectuer la synthèse du premier brin d'ADNc suivie de l'amplification du produit d'ADNc en utilisant un processus en deux étapes.

MB040-HY2 : 2x HY PCR Master Mix, avec colorant bleu

* Le master mix PCR simplifie l'assemblage de la réaction PCR et offre des avantages en termes de gain de temps, de commodité, de cohérence et de risque minimal de contamination et d'erreurs de pipetage.
* Le Master Mix PCR à haut rendement a augmenté la robustesse de l'amplification, la fidélité, le rendement et la longueur des fragments, ainsi que la capacité de gérer des modèles difficiles ou &ldquodirty&rdquo.
* Le colorant de suivi et le précipitant ont été ajoutés au PCR PreMix afin que le produit PCR puisse être directement chargé pour l'électrophorèse.

Caractéristiques du mélange d'enzyme Taq et d'une enzyme de relecture contenue dans le master mix PCR à haut rendement :
* Processivité robuste. Des fragments d'ADN génomique humain jusqu'à 10 kb et lamda de 15 kb ont été testés pour l'amplification.
* Haute pureté. >98% homogène de la Taq ADN polymérase par électrophorèse sur gel SDS. Aucune contamination détectée dans les réactions de test PCR standard.
* Résultats reproductibles. Aucun changement d'activité visible après stockage de la Taq ADN polymérase à température ambiante pendant 3 mois pour amplifier un gène à copie unique du génome humain avec une grande efficacité.
* Relecture avec activité exonucléase 5&prime.

MB041-EN-1 : mélange dNTP, 10 mM chacun

Exempt de RNase et de DNase et convient à toute application de biologie moléculaire nécessitant des désoxynucléotides purs, tels que la PCR, le séquençage d'ADN, la synthèse d'ADNc et la translation de coupure.

MB067-EQ2G / MB067-EQ2B / MB067-EQ2R : 2x PCR PreMix, avec colorant (vert, bleu ou rouge)

* Le master mix PCR simplifie l'assemblage de la réaction PCR et offre des avantages en termes de gain de temps, de commodité, de cohérence et de risque minimal de contamination et d'erreurs de pipetage.
* Le colorant de suivi et le précipitant ont été ajoutés dans le PreMix afin que le produit PCR puisse être directement chargé pour l'électrophorèse.

Caractéristiques des ADN polymérases Taq contenues dans le master mix PCR :
* Haute efficacité. Le temps d'extension de la Taq ADN polymérase est inférieur à 30 secondes par kb d'ADN. Amplifiez facilement des fragments d'ADN jusqu'à 5 kb.
* Haute pureté. >98% homogène de la Taq ADN polymérase par électrophorèse sur gel SDS. Aucune contamination détectée dans les réactions de test PCR standard.
* Résultats reproductibles. Aucun changement d'activité visible après stockage de la Taq ADN polymérase à température ambiante pendant 3 mois pour amplifier un gène à copie unique du génome humain avec une grande efficacité.
* Activité transférase terminale consistant à ajouter un seul nucléotide (adénosine) à l'extrémité 3 et 39 du produit d'extension, facilitant le clonage TA des produits PCR.

MB042-EUT : ADN polymérase Taq

* Haute efficacité. Le temps d'extension de la Taq ADN polymérase est inférieur à 30 secondes par kb d'ADN. Amplifiez facilement des fragments d'ADN jusqu'à 5 kb.
* Haute pureté. >98% homogène de la Taq ADN polymérase par électrophorèse sur gel SDS. Aucune contamination détectée dans les réactions de test PCR standard.
* Résultats reproductibles. Aucun changement d'activité visible après stockage de la Taq ADN polymérase à température ambiante pendant 3 mois pour amplifier un gène à copie unique du génome humain avec une grande efficacité.
* Activité transférase terminale consistant à ajouter un seul nucléotide (adénosine) à l'extrémité 3 & 39 du produit d'extension, facilitant le clonage TA des produits PCR.
* Coût bas : 2,5+ cents par unité. L'enzyme PCR la moins chère du marché.

MB066-EN-2 : ensemble dNTP, 100 mM chacun

Exempt de RNase et de DNase et convient à toute application de biologie moléculaire nécessitant des désoxynucléotides purs, tels que la PCR, le séquençage d'ADN, la synthèse d'ADNc et la translation de coupure.

MB073-PCR : 2x Long Taq PCR MasterMix (avec colorant)

Pour la configuration de la réaction, tout ce que vous avez à faire est d'ajouter des modèles, des amorces spécifiques et de l'eau.

MB103-11 : Cell and Tissue Direct PCR Kit (extraction rapide d'ADN génomique couplée à la PCR)

Protocole à tube unique basé sur une solution pour une extraction rapide de l'ADN génomique
Extraire l'ADN génomique de cellules animales et d'échantillons de tissus tels que la queue de souris et les cellules cultivées en <10 minutes
Pas de produits chimiques toxiques, de précipitation de l'ADN et de purification sur colonne, ni de digestion par la protéinase
Gain de temps, pratique, cohérence et risque minimal de contamination et d'erreurs de pipetage
Le colorant de suivi et le précipitant ont été ajoutés dans le PreMix afin que le produit PCR puisse être directement chargé pour l'électrophorèse.


Qu'est-ce que l'ADN polymérase ?

L'ADN polymérase est une enzyme qui catalyse la synthèse d'ADN à partir de nucléotides. C'est l'enzyme la plus précise responsable de la duplication des génomes et de la transmission de l'information génétique à la progéniture. Au cours de la division cellulaire, l'ADN polymérase duplique tout son ADN et transmet une copie à chaque cellule fille. En 1955, Arthur Kornberg a découvert l'ADN polymérase dans E Coli. La fonction de l'ADN polymérase dépend de plusieurs exigences d'ADN matrice, d'ions Mg +2, des quatre types de désoxynucléotides (dATP, dTTP, dCTP et d GTP) et d'une courte séquence d'ARN (amorce). La synthèse de l'ADN se fait dans le sens 5' vers 3' par l'ADN polymérase.

Les ADN polymérases peuvent être regroupées en sept familles différentes : A, B, C, D, X, Y et RT (Reverse transcriptase). Les rétrovirus codent pour la RT une ADN polymérase inhabituelle qui a besoin d'une matrice d'ARN pour la synthèse d'ADN. Il existe cinq types différents d'ADN polymérases trouvées chez les procaryotes pour différents rôles dans la réplication de l'ADN. L'ADN polymérase 3 est responsable de la polymérisation du nouveau brin d'ADN. L'ADN polymérase 1 est responsable de la réparation et du patch de l'ADN. Les ADN polymérases 2, 4 et 5 sont responsables de la réparation et de la relecture de l'ADN. Chez les eucaryotes, il existe 15 types distincts d'ADN polymérases. Ils comprennent cinq grandes familles.

Figure 2 : ADN polymérase

Les ADN polymérases sont utilisées dans le clonage de gènes, la PCR, le séquençage d'ADN, la détection de SNP, les diagnostics moléculaires, etc. La Taq polymérase est un type d'ADN polymérase qui peut tolérer des températures élevées et être disponible pour la synthèse d'ADN sans dégradation.


Voir la vidéo: Preparation of Buffer stocks TBE, TE and TAE - Amrita University (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Malachy

    Drôle de situation

  2. Ryton

    Sujet gracieusement

  3. Capek

    L'éducation est ce qui reste après que tout ce qu'on nous a enseigné est oublié. Si vous aimez rouler, allez en enfer. Les femmes aiment avec leurs oreilles et les hommes aiment partout où ils le doivent. Fille, parlez-vous français? Une fois que j'ai quitté le restaurant et que un salaud a marché sur ma main ...

  4. Calan

    Oui, c'est sûr .....



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