Informations

8 : Réplication de l'ADN - Biologie

8 : Réplication de l'ADN - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Chapitre 8 BSC 3271 Résultats d'apprentissage

  • Décrire la structure de l'ADN, y compris les brins antiparallèles, la structure des nucléotides (arrangement de trois composants), la règle des paires de bases, la liaison et la composition du « squelette » et la liaison entre les bases dans les « échelons ».
  • Esquissez la structure d'un nucléotide d'ADN, en marquant le phosphate, le désoxyribose et la base azotée (pas besoin de structure détaillée); indiquer quel groupe fonctionnel est lié aux carbones 3' et 5' du désoxyribose
  • Étant donné un diagramme d'une molécule d'ADN, identifiez : phosphate, désoxyribose, purine, pyrimidine, liaisons hydrogène, liaison phosphodiester, extrémité 5', extrémité 3'
  • Décrivez la structure des chromosomes et des plasmides bactériens et le type d'informations qu'ils contiennent.
  • Expliquer le but de la réplication de l'ADN dans une cellule
  • Expliquez le processus de réplication de l'ADN, y compris les rôles des enzymes primase, hélicase, ADN polymérase et ligase, la direction de la réplication et la signification de la réplication semi-conservatrice.
  • Étant donné un diagramme de réplication de l'ADN, déterminez la séquence du ou des brins nouvellement synthétisés et quel brin est le brin principal et lequel est le brin retardé.
  • Expliquez pourquoi les deux brins de la molécule d'ADN ne peuvent pas être synthétisés en continu et définissez les fragments d'Okazaki.
  • 8.1 : La structure et la fonction des génomes cellulaires
    Tout le contenu génétique d'une cellule est son génome. Les gènes codent pour des protéines, ou molécules d'ARN stables, dont chacune remplit une fonction spécifique dans la cellule. Bien que le génotype que possède une cellule reste constant, l'expression des gènes dépend des conditions environnementales. Un phénotype correspond aux caractéristiques observables d'une cellule (ou d'un organisme) à un instant donné et résulte du complément de gènes actuellement utilisé.
  • 8.2 : Structure et fonction de l'ADN
    Les acides nucléiques sont composés de nucléotides, dont chacun contient un sucre pentose, un groupe phosphate et une base azotée. Les désoxyribonucléotides dans l'ADN contiennent du désoxyribose comme sucre pentose. L'ADN contient les pyrimidines cytosine et thymine, et les purines adénine et guanine. Les nucléotides sont liés entre eux par des liaisons phosphodiester entre le groupe phosphate 5' d'un nucléotide et le groupe hydroxyle 3' d'un autre.
  • 8.3 : Réplication de l'ADN
    Le processus de réplication de l'ADN est semi-conservateur, ce qui donne deux molécules d'ADN, chacune ayant un brin parental d'ADN et un brin nouvellement synthétisé. Chez les bactéries, l'initiation de la réplication se produit à l'origine de la réplication, où l'ADN superenroulé est déroulé par l'ADN gyrase, rendu simple brin par l'hélicase et lié par une protéine de liaison simple brin pour maintenir son état simple brin.

Vignette : adapté de "File: Bidirectionnel DNA replication in Bacteria.png" par Bootan68 est sous licence CC BY-SA 3.0


8 : Réplication de l'ADN - Biologie

UNE. Réplication de l'ADN se produit pendant la phase de synthèse (S) du cycle cellulaire chez les eucaryotes

  • Étape 1: ADN hélicases dérouler la double hélice et rompre les liaisons hydrogène entre les paires de bases complémentaires pour séparer les deux brins de la double hélice fourches de réplicationsont produits
  • Étape 2: ADN polymérases se déplacer le long de chacun des brins d'ADN, en ajoutant des nucléotides complémentaires aux bases azotées exposées, selon les règles d'appariement des bases (A:T, G:C)
  • Étape 3: ADN polymérases continuer à copier jusqu'à ce que la double hélice d'ADN d'origine ait été répliquée en deux copies identiques
  • Les ADN polymérases font marche arrière pour relire les brins nouvellement synthétisés
  • supprimer le nucléotide incorrect, en le remplaçant par une base complémentaire correcte
  • mutations : taux d'erreur de 1 par milliard de nucléotides

Les fourches de réplication multiples augmentent la vitesse de réplication chez les eucaryotes

A. Chez les bactéries (procaryotes), il n'y a qu'un seul point d'initiation et deux fourches de réplication car il y a si peu d'ADN

B. Étant donné que les cellules eucaryotes contiennent tellement d'ADN, chaque chromosome est répliqué en environ 100 sections, chacune de 100 000 nucléotides de long, pour les humains et un processus de 8 heures


Contenu

Dans la seconde moitié du 19ème siècle, les travaux pionniers de Gregor Mendel sur l'hérédité des traits chez les plantes de pois suggèrent que des « facteurs » spécifiques (aujourd'hui établis sous forme de gènes) sont responsables du transfert de traits d'organismes entre générations. [4] Bien que les protéines aient été initialement supposées servir de matériel héréditaire, Avery, MacLeod et McCarty ont établi un siècle plus tard l'ADN, qui avait été découvert par Friedrich Miescher, comme porteur de l'information génétique. [5] Ces découvertes ont ouvert la voie à des recherches découvrant la nature chimique de l'ADN et les règles de codage de l'information génétique, et ont finalement conduit à la proposition de la structure en double hélice de l'ADN par Watson et Crick. [6] Ce modèle tridimensionnel de l'ADN a éclairé les mécanismes potentiels par lesquels l'information génétique pourrait être copiée de manière semi-conservatrice avant la division cellulaire, une hypothèse qui a ensuite été soutenue expérimentalement par Meselson et Stahl en utilisant l'incorporation d'isotopes pour distinguer les parents des nouveaux synthétisés. ADN. [7] [8] L'isolement ultérieur des ADN polymérases, les enzymes qui catalysent la synthèse de nouveaux brins d'ADN, par Kornberg et ses collègues ont été les premiers à identifier de nombreux composants différents de la machinerie biologique de réplication de l'ADN, d'abord dans l'organisme modèle bactérien. E. coli, mais plus tard aussi dans les formes de vie eucaryotes. [2] [9]

Une condition préalable clé pour la réplication de l'ADN est qu'elle doit se produire avec une fidélité et une efficacité extrêmement élevées exactement une fois par cycle cellulaire pour empêcher l'accumulation d'altérations génétiques avec des conséquences potentiellement délétères pour la survie des cellules et la viabilité des organismes. [10] Des événements de réplication de l'ADN incomplets, erronés ou intempestifs peuvent entraîner des mutations, une polyploïdie ou une aneuploïdie chromosomique et des variations du nombre de copies de gènes, chacune pouvant à son tour entraîner des maladies, notamment le cancer. [11] [12] Pour assurer une duplication complète et précise de l'ensemble du génome et le flux correct d'informations génétiques vers les cellules de la descendance, tous les événements de réplication de l'ADN sont non seulement étroitement régulés par les signaux du cycle cellulaire, mais sont également coordonnés avec d'autres événements cellulaires tels que transcription et réparation de l'ADN. [2] [13] [14] [15] De plus, les séquences d'origine ont généralement une teneur élevée en AT dans tous les règnes, car les répétitions de l'adénine et de la thymine sont plus faciles à séparer car leurs interactions d'empilement de bases ne sont pas aussi fortes que celles de la guanine et cytosine. [16]

La réplication de l'ADN est divisée en différentes étapes. Au cours de l'initiation, les machineries de réplication - appelées réplisomes - sont assemblées sur l'ADN de manière bidirectionnelle. Ces loci d'assemblage constituent les sites de départ de la réplication de l'ADN ou des origines de réplication. Dans la phase d'élongation, les réplisomes se déplacent dans des directions opposées avec les fourches de réplication, déroulant l'hélice d'ADN et synthétisant des brins d'ADN filles complémentaires en utilisant les deux brins parentaux comme matrices. Une fois la réplication terminée, des événements de terminaison spécifiques conduisent au désassemblage des réplisomes. Tant que le génome entier est dupliqué avant la division cellulaire, on pourrait supposer que l'emplacement des sites de démarrage de la réplication n'a pas encore d'importance, il a été démontré que de nombreux organismes utilisent des régions génomiques préférées comme origines. [17] [18] La nécessité de réguler l'emplacement de l'origine découle probablement de la nécessité de coordonner la réplication de l'ADN avec d'autres processus qui agissent sur la matrice de chromatine partagée pour éviter les cassures de brin d'ADN et les dommages à l'ADN. [2] [12] [15] [19] [20] [21] [22] [23]

Il y a plus de cinq décennies, Jacob, Brenner et Cuzin ont proposé l'hypothèse du réplicon pour expliquer la régulation de la synthèse de l'ADN chromosomique dans E. coli. [24] Le modèle postule qu'un trans-le facteur agissant, un soi-disant initiateur, interagit avec un cis-élément d'ADN agissant, le réplicateur, pour favoriser l'apparition de la réplication à une origine proche. Une fois liés aux réplicateurs, les initiateurs (souvent à l'aide de protéines co-chargeuses) déposent des hélicases réplicatives sur l'ADN, qui entraînent ensuite le recrutement de composants réplisomes supplémentaires et l'assemblage de l'ensemble de la machinerie de réplication. Le réplicateur spécifie ainsi l'emplacement des événements d'initiation de la réplication, et la région chromosomique qui est répliquée à partir d'une seule origine ou événement d'initiation est définie comme le réplicon. [2]

Une caractéristique fondamentale de l'hypothèse du réplicon est qu'elle repose sur une régulation positive pour contrôler l'apparition de la réplication de l'ADN, ce qui peut expliquer de nombreuses observations expérimentales dans les systèmes bactériens et phagiques. [24] Par exemple, cela explique l'échec des ADN extrachromosomiques sans origines à se répliquer lorsqu'ils sont introduits dans des cellules hôtes. Il rationalise davantage les incompatibilités plasmidiques dans E. coli, où certains plasmides se déstabilisent mutuellement en raison de la compétition pour la même machinerie d'initiation moléculaire. [25] En revanche, un modèle de régulation négative (analogue au modèle de réplicon-opérateur pour la transcription) ne parvient pas à expliquer les résultats ci-dessus. [24] Néanmoins, les recherches postérieures à la proposition de Jacob, Brenner et Cuzin du modèle de réplicon ont découvert de nombreuses couches supplémentaires de contrôle de la réplication chez les bactéries et les eucaryotes qui comprennent à la fois des éléments régulateurs positifs et négatifs, soulignant à la fois la complexité et l'importance de restreindre la réplication de l'ADN. temporellement et spatialement. [2] [26] [27] [28]

Le concept de réplicateur en tant qu'entité génétique s'est avéré très utile dans la quête d'identification des séquences d'ADN réplicateur et des protéines initiatrices chez les procaryotes, et dans une certaine mesure également chez les eucaryotes, bien que l'organisation et la complexité des réplicateurs diffèrent considérablement entre les domaines de la vie. [29] [30] Alors que les génomes bactériens contiennent généralement un seul réplicateur qui est spécifié par des éléments de séquence d'ADN consensus et qui contrôle la réplication de l'ensemble du chromosome, la plupart des réplicateurs eucaryotes - à l'exception de la levure en herbe - ne sont pas définis au niveau de l'ADN à la place, ils semblent être spécifiés de manière combinatoire par des indices locaux de structure d'ADN et de chromatine. [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] Les chromosomes eucaryotes sont également beaucoup plus gros que leurs homologues bactériens, d'où la nécessité d'initier la synthèse d'ADN à partir de nombreux origines simultanément pour assurer la réplication rapide de l'ensemble du génome. De plus, beaucoup plus d'hélicases réplicatives sont chargées qu'activées pour initier la réplication dans un cycle cellulaire donné. La définition contextuelle des réplicateurs et la sélection des origines suggèrent un modèle de réplicon détendu dans les systèmes eucaryotes qui permet une flexibilité dans le programme de réplication de l'ADN. [29] Bien que les réplicateurs et les origines puissent être physiquement espacés sur les chromosomes, ils se co-localisent souvent ou sont situés à proximité immédiate pour plus de simplicité, nous désignerons donc les deux éléments comme « origines » tout au long de cette revue. Pris ensemble, la découverte et l'isolement des séquences d'origine dans divers organismes représentent une étape importante vers l'acquisition d'une compréhension mécanistique de l'initiation de la réplication. De plus, ces réalisations ont eu de profondes implications biotechnologiques pour le développement de vecteurs navettes qui peuvent être propagés dans des cellules bactériennes, de levure et de mammifère. [2] [41] [42] [43]

La plupart des chromosomes bactériens sont circulaires et contiennent une seule origine de réplication chromosomique (oriC). Bactérien oriC les régions sont étonnamment diverses en taille (allant de 250 pb à 2 kpb), en séquence et en organisation [45] [46] néanmoins, leur capacité à entraîner le déclenchement de la réplication dépend généralement de la lecture spécifique à la séquence des éléments d'ADN consensus par l'initiateur bactérien, une protéine appelée ADNA. [47] [48] [49] [50] Les origines des bactéries sont soit continues, soit bipartites et contiennent trois éléments fonctionnels qui contrôlent l'activité d'origine : des répétitions d'ADN conservées qui sont spécifiquement reconnues par l'ADN (appelées boîtes à ADN), un Élément de déroulement de l'ADN (DUE) et sites de liaison pour les protéines qui aident à réguler l'initiation de la réplication. [17] [51] [52] Les interactions de l'ADN à la fois avec les régions de la boîte à ADN double brin (ds) et avec l'ADN simple brin (ss) dans le DUE sont importantes pour l'activation de l'origine et sont médiées par différents domaines dans le protéine initiatrice : un élément de liaison à l'ADN Helix-turn-helix (HTH) et une ATPase associée à diverses activités cellulaires (AAA+), respectivement. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] Alors que la séquence, le nombre et l'arrangement des boîtes à ADN associées à l'origine varient dans tout le règne bactérien, leur positionnement et leur espacement spécifiques dans un espèces sont essentielles pour oriC fonction et pour la formation du complexe d'initiation productive. [2] [45] [46] [60] [61] [62] [63] [64]

Parmi les bactéries, E. coli est un système modèle particulièrement puissant pour étudier l'organisation, la reconnaissance et le mécanisme d'activation des origines de réplication. E. coli oriC comprend environ

Région de 260 pb contenant quatre types d'éléments de liaison à l'initiateur qui diffèrent par leurs affinités pour l'ADNA et leurs dépendances vis-à-vis du cofacteur ATP. Les boîtes DnaA R1, R2 et R4 constituent des sites de haute affinité qui sont liés par le domaine HTH de DnaA quel que soit l'état de liaison aux nucléotides de l'initiateur. [47] [65] [66] [67] [68] [69] En revanche, les sites I, et C, qui sont intercalés entre les sites R, sont des boîtes DnaA de faible affinité et s'associent préférentiellement avec l'ADNA lié à l'ATP, bien que l'ADP-DnaA puisse se substituer à l'ATP-DnaA dans certaines conditions. [70] [71] [72] [63] La liaison des domaines HTH aux éléments de reconnaissance DnaA de haute et basse affinité favorise l'oligomérisation d'ordre supérieur dépendante de l'ATP des modules AAA+ de DnaA en un filament droitier qui enveloppe l'ADN duplex autour de sa surface externe, générant ainsi une torsion superhélicoïdale qui facilite la fusion du DUE adjacent riche en AT. [53] [73] [74] [75] La séparation des brins d'ADN est en outre facilitée par les interactions directes du domaine AAA+ ATPase de DnaA avec des répétitions de triplet, appelées DnaA-trios, dans la région DUE proximale. [76] L'engagement des segments trinucléotidiques simple brin par le filament initiateur étire l'ADN et stabilise la bulle d'initiation en empêchant le réannelage. [57] L'élément d'origine DnaA-trio est conservé dans de nombreuses espèces bactériennes, ce qui indique qu'il s'agit d'un élément clé pour la fonction d'origine. [76] Après la fonte, le DUE fournit un site d'entrée pour le E. coli hélicase réplicative DnaB, qui est déposée sur chacun des brins d'ADN par sa protéine de charge DnaC. [2]

Bien que les différentes activités de liaison à l'ADN de DnaA aient été largement étudiées sur le plan biochimique et divers apo, ssDNA-, ou dsDNA-bound structures ont été déterminés, [56] [57] [58] [74] l'architecture exacte de l'ADN d'ordre supérieur-oriC l'assemblage initiatique reste flou. Deux modèles ont été proposés pour expliquer l'organisation des éléments d'origine essentiels et médiée par l'ADNA. oriC fusion. Le modèle à deux états suppose un filament d'ADN continu qui passe d'un mode de liaison ADNdb (le complexe organisateur) à un mode de liaison ADNsb dans le DUE (le complexe de fusion). [74] [77] En revanche, dans le modèle de bouclage, l'ADN est fortement courbé en oriC et se replie sur le filament initiateur de sorte que les protomères d'ADNA engagent simultanément les régions d'ADN double et simple brin. [78] Expliquer comment exactement oriC L'ADN est organisé par l'ADNA reste donc une tâche importante pour les études futures. Un aperçu de l'architecture complexe d'initiation aidera à expliquer non seulement comment l'ADN d'origine est fondu, mais aussi comment une hélicase réplicative est chargée de manière directionnelle sur chacun des brins d'ADN simples exposés dans le DUE déroulé, et comment ces événements sont aidés par les interactions de l'hélicase avec l'initiateur et les protéines chargeuses spécifiques. [2]

Les origines de réplication archéennes partagent certaines mais pas toutes les caractéristiques organisationnelles des bactéries oriC. Contrairement aux bactéries, les archées initient souvent une réplication à partir de plusieurs origines par chromosome (une à quatre ont été rapportées) [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [46] pourtant, les archées les origines portent également des régions de séquences spécialisées qui contrôlent la fonction d'origine. [87] [88] [89] Ces éléments comprennent à la fois des boîtes de reconnaissance d'origine spécifiques à la séquence d'ADN (ORB ou miniORB) et un DUE riche en AT qui est flanqué d'une ou plusieurs régions ORB. [85] [90] Les éléments ORB présentent un degré considérable de diversité en termes de nombre, d'arrangement et de séquence, à la fois parmi les différentes espèces d'archées et parmi les différentes origines au sein d'une même espèce. [80] [85] [91] Un degré supplémentaire de complexité est introduit par l'initiateur, Orc1/Cdc6 in archaea, qui se lie aux régions ORB. Les génomes archéens codent généralement pour plusieurs paralogues d'Orc1/Cdc6 qui varient considérablement dans leurs affinités pour des éléments ORB distincts et qui contribuent différemment aux activités d'origine. [85] [92] [93] [94] Dans Sulfolobus solfataricus, par exemple, trois origines chromosomiques ont été cartographiées (oriC1, oriC2 et oriC3), et des études biochimiques ont révélé des modèles de liaison complexes d'initiateurs sur ces sites. [85] [86] [95] [96] L'initiateur apparenté pour oriC1 est Orc1-1, qui s'associe à plusieurs ORB à cette origine. [85] [93] OriC2 et oriC3 sont liés à la fois par Orc1-1 et Orc1-3. [85] [93] [96] À l'inverse, un troisième paralogue, Orc1-2, empreinte de pas à toutes les trois origines mais a été postulé pour réguler négativement l'initiation de réplication. [85] [96] De plus, il a été démontré que la protéine WhiP, un initiateur non lié à Orc1/Cdc6, se lie également à toutes les origines et dirige l'activité d'origine d'oriC3 dans le système étroitement lié. Sulfolobus islandicus. [93] [95] Étant donné que les origines archéennes contiennent souvent plusieurs éléments ORB adjacents, plusieurs paralogues Orc1/Cdc6 peuvent être simultanément recrutés dans une origine et oligomériser dans certains cas [94] [97] cependant, contrairement à l'ADN bactérien, la formation d'un l'assemblage d'initiateurs d'ordre supérieur ne semble pas être une condition préalable générale à la fonction d'origine dans le domaine archéen. [2]

Des études structurelles ont fourni des informations sur la façon dont les archées Orc1/Cdc6 reconnaissent les éléments ORB et remodèlent l'ADN d'origine. [97] [98] Les paralogues Orc1/Cdc6 sont des protéines à deux domaines et sont composés d'un module AAA+ ATPase fusionné à un repliement en hélice ailée C-terminal. [99] [100] [101] Les structures complexes d'ADN d'Orc1/Cdc6 ont révélé que les ORB sont liés par un monomère Orc1/Cdc6 malgré la présence de séquences répétées inversées dans les éléments ORB. [97] [98] Les régions d'ATPase et d'hélice ailée interagissent avec le duplex d'ADN mais entrent en contact asymétriquement avec la séquence de répétition ORB palindromique, ce qui oriente Orc1/Cdc6 dans une direction spécifique sur la répétition. [97] [98] Il est intéressant de noter que les éléments ORB ou miniORB flanquant le DUE ont souvent des polarités opposées, [80] [85] [94] [102] [103] qui prédit que les sous-domaines AAA+ du couvercle et les domaines à hélice ailée de Orc1/Cdc6 sont positionnés de chaque côté du DUE de manière à se faire face. [97] [98] Étant donné que les deux régions d'Orc1/Cdc6 s'associent à une hélicase réplicative de maintenance des minichromosomes (MCM), [104] [105] cet arrangement spécifique des éléments ORB et Orc1/Cdc6 est probablement important pour charger deux complexes MCM symétriquement sur le DUE. [85] Étonnamment, alors que la séquence d'ADN ORB détermine la directionnalité de la liaison Orc1/Cdc6, l'initiateur fait relativement peu de contacts spécifiques à la séquence avec l'ADN. [97] [98] Cependant, Orc1/Cdc6 sous-tend gravement et plie l'ADN, suggérant qu'il repose sur un mélange de séquence d'ADN et de caractéristiques structurelles d'ADN dépendantes du contexte pour reconnaître les origines. [97] [98] [106] Notamment, l'appariement des bases est maintenu dans le duplex d'ADN déformé lors de la liaison Orc1/Cdc6 dans les structures cristallines, [97] [98] alors que les études biochimiques ont donné des résultats contradictoires quant à savoir si les initiateurs archéens peuvent fondre ADN similaire à l'ADN bactérien. [93] [94] [107] Bien que la parenté évolutive des initiateurs archéens et eucaryotes et des hélicases réplicatives indique que le MCM archéen est probablement chargé sur l'ADN duplex (voir la section suivante), l'ordre temporel de fusion d'origine et de chargement d'hélicase, ainsi que le mécanisme de fusion de l'ADN d'origine, dans les systèmes archéens, reste donc à être clairement établi. De même, la manière exacte dont l'hélicase MCM est chargée sur l'ADN doit être abordée dans les études futures. [2]

L'organisation, la spécification et l'activation de l'origine chez les eucaryotes sont plus complexes que dans les domaines bactériens ou archéens et s'écartent considérablement du paradigme établi pour l'initiation de la réplication procaryote. Les grandes tailles de génome des cellules eucaryotes, qui vont de 12 Mbp en S. cerevisiae à 3 Gbp chez l'homme, nécessite que la réplication de l'ADN commence à plusieurs centaines (chez la levure en herbe) à des dizaines de milliers (chez l'homme) d'origines pour achever la réplication de l'ADN de tous les chromosomes au cours de chaque cycle cellulaire. [27] [36] A l'exception de S. cerevisiae et liés Saccharomycotine espèces, les origines eucaryotes ne contiennent pas d'éléments de séquence d'ADN consensus, mais leur emplacement est influencé par des indices contextuels tels que la topologie locale de l'ADN, les caractéristiques structurelles de l'ADN et l'environnement de la chromatine. [110] [35] [37] Néanmoins, la fonction d'origine eucaryote repose toujours sur un complexe protéique d'initiateur conservé pour charger des hélicases réplicatives sur l'ADN pendant les phases tardives M et G1 du cycle cellulaire, une étape connue sous le nom de licence d'origine. [111] Contrairement à leurs homologues bactériennes, les hélicases réplicatives chez les eucaryotes sont chargées sur l'ADN duplex d'origine sous une forme inactive à double hexamère et seul un sous-ensemble d'entre elles (10-20% dans les cellules de mammifères) est activé pendant une phase S donnée. , événements appelés déclenchement d'origine. [112] [113] [114] L'emplacement des origines eucaryotes actives est donc déterminé à au moins deux niveaux différents, la licence d'origine pour marquer toutes les origines potentielles, et le tir d'origine pour sélectionner un sous-ensemble qui permet l'assemblage de la machinerie de réplication et l'initiation de synthèse d'ADN. Les origines sous licence supplémentaires servent de sauvegarde et ne sont activées que lors du ralentissement ou du blocage des fourches de réplication à proximité, garantissant que la réplication de l'ADN peut être terminée lorsque les cellules rencontrent un stress de réplication. [115] [116] Ensemble, l'excès d'origines sous licence et le contrôle strict du cycle cellulaire des licences d'origine et de la mise à feu incarnent deux stratégies importantes pour empêcher la sous-réplication et la sur-réplication et pour maintenir l'intégrité des génomes eucaryotes. [2]

Les premières études en S. cerevisiae ont indiqué que les origines de réplication chez les eucaryotes pourraient être reconnues d'une manière spécifique à la séquence d'ADN de manière analogue à celles des procaryotes. Chez la levure bourgeonnante, la recherche de réplicateurs génétiques conduit à l'identification de séquences à réplication autonome (ARS) qui soutiennent l'initiation efficace de la réplication de l'ADN extrachromosomique. [117] [118] [119] Ces régions ARS ont une longueur d'environ 100 à 200 pb et présentent une organisation multipartite, contenant des éléments A, B1, B2 et parfois B3 qui, ensemble, sont essentiels à la fonction d'origine. [120] [121] L'élément A englobe la séquence consensus ARS conservée de 11 pb (ACS), [122] [123] qui, en conjonction avec l'élément B1, constitue le site de liaison primaire pour le complexe de reconnaissance d'origine hétérohexamère (ORC) , l'initiateur de la réplication eucaryote. [124] [125] [126] [127] Au sein de l'ORC, cinq sous-unités reposent sur des plis conservés d'AAA+ ATPase et d'hélice ailée et se co-assemblent en un anneau pentamérique qui entoure l'ADN. [127] [128] [129] Dans la levure ORC en herbe, les éléments de liaison à l'ADN dans les domaines ATPase et en hélice ailée, ainsi que les régions de patch basiques adjacentes dans certaines des sous-unités ORC, sont positionnés dans le pore central de l'anneau ORC de telle sorte qu'ils facilitent la reconnaissance spécifique de la séquence d'ADN de l'ACS d'une manière dépendante de l'ATP. [127] [130] En revanche, les rôles des éléments B2 et B3 sont moins clairs. La région B2 est similaire à l'ACS dans sa séquence et il a été suggéré qu'elle fonctionne comme un second site de liaison ORC dans certaines conditions, ou comme un site de liaison pour le noyau d'hélicase réplicatif. [131] [132] [133] [134] [135] A l'inverse, l'élément B3 recrute le facteur de transcription Abf1, bien que B3 ne soit pas retrouvé dans toutes les origines de levures bourgeonnantes et la liaison à Abf1 ne semble pas être strictement essentielle pour la fonction d'origine. [2] [120] [136] [137]

Reconnaissance de l'origine chez les eucaryotes autres que S. cerevisiae ou ses proches parents ne sont pas conformes à la lecture spécifique à la séquence des éléments d'ADN d'origine conservés. Les recherches visant à isoler des séquences de réplication chromosomiques spécifiques plus généralement chez les espèces eucaryotes, soit génétiquement, soit par cartographie à l'échelle du génome des sites de liaison à l'initiateur ou de démarrage de la réplication, n'ont pas réussi à identifier des séquences consensus claires aux origines. [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] Ainsi, les interactions ADN-initiateur spécifiques à la séquence chez la levure en herbe signifient un mode spécialisé pour la reconnaissance de l'origine dans ce système plutôt qu'un mode archétypal pour la spécification de l'origine dans le domaine eucaryote. Néanmoins, la réplication de l'ADN s'initie sur des sites discrets qui ne sont pas répartis au hasard dans les génomes eucaryotes, arguant que des moyens alternatifs déterminent l'emplacement chromosomique des origines dans ces systèmes. Ces mécanismes impliquent une interaction complexe entre l'accessibilité de l'ADN, l'asymétrie de la séquence nucléotidique (la richesse en AT et les îles CpG ont été liées aux origines), le positionnement des nucléosomes, les caractéristiques épigénétiques, la topologie de l'ADN et certaines caractéristiques structurelles de l'ADN (par exemple, les motifs G4), ainsi que comme protéines régulatrices et interférence transcriptionnelle. [17] [18] [34] [35] [37] [150] [151] [143] [152] Il est important de noter que les propriétés d'origine varient non seulement entre différentes origines dans un organisme et entre les espèces, mais certaines peuvent également changer au cours développement et différenciation cellulaire. Le locus du chorion dans Drosophile les cellules folliculaires constituent un exemple bien établi pour le contrôle spatial et développemental des événements d'initiation. Cette région subit une amplification génique dépendante de la réplication de l'ADN à un stade défini au cours de l'ovogenèse et repose sur l'activation ponctuelle et spécifique des origines du chorion, qui à son tour est régulée par des éléments cis spécifiques à l'origine et plusieurs facteurs protéiques, y compris le complexe Myb, E2F1 et E2F2. [153] [154] [155] [156] [157] Cette spécification combinatoire et la régulation multifactorielle des origines des métazoaires ont compliqué l'identification des caractéristiques unificatrices qui déterminent l'emplacement des sites de départ de la réplication à travers les eucaryotes de manière plus générale. [2]

Pour faciliter l'initiation de la réplication et la reconnaissance de l'origine, les assemblages ORC de diverses espèces ont développé des domaines auxiliaires spécialisés qui sont censés aider l'initiateur à cibler les origines chromosomiques ou les chromosomes en général. Par exemple, la sous-unité Orc4 dans S. pombe ORC contient plusieurs AT-hooks qui se lient préférentiellement à l'ADN riche en AT, [158] tandis que dans l'ORC métazoaire, le domaine de type TFIIB d'Orc6 est censé remplir une fonction similaire. [159] Les protéines du métazoaire Orc1 abritent également un domaine d'homologie bromo-adjacent (BAH) qui interagit avec les nucléosomes H4K20me2. [109] En particulier dans les cellules de mammifères, il a été rapporté que la méthylation de H4K20 était nécessaire pour une initiation de réplication efficace, et le domaine Orc1-BAH facilite l'association ORC avec les chromosomes et la réplication dépendante de l'origine du virus d'Epstein-Barr. [160] [161] [162] [163] [164] Par conséquent, il est intéressant de spéculer que les deux observations sont liées mécaniquement au moins dans un sous-ensemble de métazoaires, mais cette possibilité doit être explorée plus avant dans de futures études. En plus de la reconnaissance de certains ADN ou caractéristiques épigénétiques, ORC s'associe également directement ou indirectement à plusieurs protéines partenaires qui pourraient aider au recrutement d'initiateurs, notamment LRWD1, PHIP (ou DCAF14), HMGA1a, entre autres. [33] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] Fait intéressant, Drosophile L'ORC, comme son homologue de levure en herbe, plie l'ADN et il a été rapporté que le superenroulement négatif améliore la liaison à l'ADN de ce complexe, suggérant que la forme et la malléabilité de l'ADN pourraient influencer l'emplacement des sites de liaison ORC à travers les génomes des métazoaires. [31] [127] [172] [173] [174] Une compréhension moléculaire de la façon dont les régions de liaison à l'ADN de l'ORC pourraient prendre en charge la lecture des propriétés structurelles du duplex d'ADN chez les métazoaires plutôt que de séquences d'ADN spécifiques comme dans S. cerevisiae attend des informations structurelles à haute résolution des assemblages d'initiateurs de métazoaires liés à l'ADN. De même, la question de savoir si et comment différents facteurs épigénétiques contribuent au recrutement d'initiateurs dans les systèmes de métazoaires est mal définie et constitue une question importante qui doit être traitée plus en détail. [2]

Une fois recrutés aux origines, ORC et ses cofacteurs Cdc6 et Cdt1 entraînent le dépôt du complexe de maintenance des minichromosomes 2-7 (Mcm2-7) sur l'ADN. [111] [175] Comme le noyau d'hélicase réplicatif archéen, Mcm2-7 est chargé en tant que double hexamère tête à tête sur l'ADN pour autoriser les origines. [112] [113] [114] En phase S, la kinase dépendante de la Dbf4 (DDK) et la kinase dépendante de la cycline (CDK) phosphorylent plusieurs sous-unités Mcm2-7 et des facteurs d'initiation supplémentaires pour favoriser le recrutement des co-activateurs de l'hélicase Cdc45 et GINS, fusion de l'ADN et, finalement, assemblage de réplisomes bidirectionnel dans un sous-ensemble des origines autorisées. [28] [176] Chez la levure et les métazoaires, les origines sont exemptes ou appauvries de nucléosomes, une propriété cruciale pour la charge Mcm2-7, indiquant que l'état de la chromatine aux origines régule non seulement le recrutement de l'initiateur mais aussi la charge de l'hélicase. [144] [177] [178] [179] [180] [181] Un environnement de chromatine permissif est en outre important pour l'activation de l'origine et a été impliqué dans la régulation à la fois de l'efficacité de l'origine et du moment de la mise à feu de l'origine. Les origines euchromatiques contiennent généralement des marques de chromatine actives, se répliquent tôt et sont plus efficaces que les origines hétérochromatiques à réplication tardive, qui à l'inverse sont caractérisées par des marques répressives. [27] [179] [182] Il n'est pas surprenant que plusieurs remodeleurs de la chromatine et enzymes modifiant la chromatine se soient associés aux origines et à certains facteurs d'initiation, [183] ​​[184] mais la manière dont leurs activités impactent différents événements d'initiation de la réplication reste largement obscure. . Remarquablement, des «éléments de contrôle de réplication précoce» (ECRE) à action cis ont également été récemment identifiés pour aider à réguler le calendrier de réplication et à influencer l'architecture du génome 3D dans les cellules de mammifères. [185] La compréhension des mécanismes moléculaires et biochimiques qui orchestrent cette interaction complexe entre l'organisation du génome 3D, la structure de la chromatine locale et d'ordre supérieur et l'initiation de la réplication est un sujet passionnant pour des études ultérieures. [2]

Pourquoi les origines de réplication des métazoaires ont-elles divergé du paradigme de reconnaissance spécifique à la séquence d'ADN qui détermine les sites de démarrage de la réplication chez les procaryotes et les levures bourgeonnantes ? Observations que les origines des métazoaires co-localisent souvent avec les régions promotrices dans Drosophile et les cellules de mammifères et que les conflits de réplication-transcription dus aux collisions des machineries moléculaires sous-jacentes peuvent entraîner des dommages à l'ADN suggèrent qu'une bonne coordination de la transcription et de la réplication est importante pour maintenir la stabilité du génome. [139] [141] [143] [146] [186] [20] [187] [188] Des découvertes récentes indiquent également un rôle plus direct de la transcription dans l'influence de la localisation des origines, soit en inhibant la charge Mcm2-7 ou par repositionnement de Mcm2-7 chargés sur les chromosomes. [189] [152] Sequence-independent (but not necessarily random) initiator binding to DNA additionally allows for flexibility in specifying helicase loading sites and, together with transcriptional interference and the variability in activation efficiencies of licensed origins, likely determines origin location and contributes to the co-regulation of DNA replication and transcriptional programs during development and cell fate transitions. Computational modeling of initiation events in S. pombe, as well as the identification of cell-type specific and developmentally-regulated origins in metazoans, are in agreement with this notion. [140] [148] [190] [191] [192] [193] [194] [152] However, a large degree of flexibility in origin choice also exists among different cells within a single population, [143] [149] [191] albeit the molecular mechanisms that lead to the heterogeneity in origin usage remain ill-defined. Mapping origins in single cells in metazoan systems and correlating these initiation events with single-cell gene expression and chromatin status will be important to elucidate whether origin choice is purely stochastic or controlled in a defined manner. [2]


Prokaryotes vs. Eukaryotes

DNA replication overall is fairly conserved across life. However, general differences exist in the enzymes and mechanisms used, as well as time required between species. The largest differences are between the domains of prokaryotes (bacteria and archaea) and eukaryotes (all other plant and animal cells).

Minor differences between these groups include faster replication time in prokaryotes and shorter Okazaki fragments in eukaryotes. Additionally, prokaryotes only have a single origin of replication, while eukaryotes have multiple origins of replication. The most noteworthy difference between these groups however, is that prokaryotes have circular DNA while eukaryotes have linear DNA. Linear eukaryotic DNA creates an additional challenge that must be regulated. This brings us to telomeres.

Télomères

Because eukaryotic DNA is linear, they have ends that create a challenge. For the leading strand, DNA polymerase III can continue down the entire length of DNA. However, in the lagging strand, a primer must be added in front of the Okazaki fragment being synthesized before DNA polymerase III can attach and synthesize the new DNA strand opposite of the replication fork. Once the last Okazaki fragment is synthesized, a small DNA segment is leftover at the tip of the strand. This segment cannot be left unattended. If this DNA isn’t replicated, then genetic material will be lost each time replication occurs. After several replication cycles, this can result in lost information that could be critical for the individual to survive.

To solve this issue, télomères are present in eukaryotes. Telomeres are short, repeating segments of DNA that are found at the end of each chromosome and do not contain any coding sequences. These telomeres are synthesized by télomérase, which is an enzyme that contains a short RNA template used to extend the length of the lagging strand. Primers are placed on the telomere where DNA polymerase III can attach to synthesize the final portion of DNA leftover on the lagging strand.

Telomere replication on the lagging strand is as follows:

  1. Telomerase attaches to the very end of the lagging strand, overhanging the unreplicated portion of DNA.
  2. Using its own RNA template, telomerase synthesizes the extending telomere, adding additional bases to the 3’ end of the lagging strand.
  3. Primase adds the primer on the telomere.
  4. DNA polymerase III binds to the primer and moves opposite of telomerase to complete the synthesis of the lagging strand.

Telomeres Affect Cell Age

Telomerase is most commonly active in cell types that divide rapidly, such as with embryonic cells, stem cells, sperm cells, and immune cells. In most other cell types, telomerase activity is turned off, and telomeres become shorter with each DNA replication. This means that cells have a limited number of times that they are able to divide via mitosis before signals are sent to prevent further divisions and DNA damage. As a result, cells have age.

Research has found that increasing telomere length can also increase the lifespan of the cell. While this offers a potential treatment to growth limiting cellular diseases, it also unfortunately assists cancer persistence and survival. Approximately 90% of cancer cells have mutated to turn on telomerase activity in cell types where it should be turned off. This causes another mechanism in which cancer cells can continue to divide without control and become immortalized. Research is ongoing to determine if/how deactivating telomerase activity can either slow or stop cancer progression.


Réplication de l'ADN chez les procaryotes

Prokaryotic DNA is replicated by DNA polymerase III in the 5′ to 3′ direction at a rate of 1000 nucleotides per second.

Objectifs d'apprentissage

Explain the functions of the enzymes involved in prokaryotic DNA replication

Points clés à retenir

Points clés

  • Helicase separates the DNA to form a replication fork at the origin of replication where DNA replication begins.
  • Replication forks extend bi-directionally as replication continues.
  • Okazaki fragments are formed on the lagging strand, while the leading strand is replicated continuously.
  • DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments.
  • Primase synthesizes an RNA primer with a free 3′-OH, which DNA polymerase III uses to synthesize the daughter strands.

Mots clés

  • Réplication de l'ADN: a biological process occuring in all living organisms that is the basis for biological inheritance
  • hélicase: an enzyme that unwinds the DNA helix ahead of the replication machinery
  • origine de réplication: a particular sequence in a genome at which replication is initiated

Réplication de l'ADN chez les procaryotes

DNA replication employs a large number of proteins and enzymes, each of which plays a critical role during the process. One of the key players is the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides one by one to the growing DNA chain that are complementary to the template strand. The addition of nucleotides requires energy this energy is obtained from the nucleotides that have three phosphates attached to them, similar to ATP which has three phosphate groups attached. When the bond between the phosphates is broken, the energy released is used to form the phosphodiester bond between the incoming nucleotide and the growing chain. In prokaryotes, three main types of polymerases are known: DNA pol I, DNA pol II, and DNA pol III. DNA pol III is the enzyme required for DNA synthesis DNA pol I and DNA pol II are primarily required for repair.

There are specific nucleotide sequences called origins of replication where replication begins. Dans E. coli, which has a single origin of replication on its one chromosome (as do most prokaryotes), it is approximately 245 base pairs long and is rich in AT sequences. The origin of replication is recognized by certain proteins that bind to this site. An enzyme called helicase unwinds the DNA by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous base pairs. ATP hydrolysis is required for this process. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks at the origin of replication are extended bi-directionally as replication proceeds. Single-strand binding proteins coat the strands of DNA near the replication fork to prevent the single-stranded DNA from winding back into a double helix. DNA polymerase is able to add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction (a new DNA strand can be extended only in this direction). It also requires a free 3′-OH group to which it can add nucleotides by forming a phosphodiester bond between the 3′-OH end and the 5′ phosphate of the next nucleotide. This means that it cannot add nucleotides if a free 3′-OH group is not available. Another enzyme, RNA primase, synthesizes an RNA primer that is about five to ten nucleotides long and complementary to the DNA, priming DNA synthesis. A primer provides the free 3′-OH end to start replication. DNA polymerase then extends this RNA primer, adding nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

Réplication de l'ADN chez les procaryotes: A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. The DNA tends to become more highly coiled ahead of the replication fork. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this supercoiling. Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA to prevent the helix from re-forming. Primase synthesizes an RNA primer. DNA polymerase III uses this primer to synthesize the daughter DNA strand. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. DNA polymerase I replaces the RNA primer with DNA. DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments, joining the fragments into a single DNA molecule.

The replication fork moves at the rate of 1000 nucleotides per second. DNA polymerase can only extend in the 5′ to 3′ direction, which poses a slight problem at the replication fork. As we know, the DNA double helix is anti-parallel that is, one strand is in the 5′ to 3′ direction and the other is oriented in the 3′ to 5′ direction. One strand (the leading strand), complementary to the 3′ to 5′ parental DNA strand, is synthesized continuously towards the replication fork because the polymerase can add nucleotides in this direction. The other strand (the lagging strand), complementary to the 5′ to 3′ parental DNA, is extended away from the replication fork in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. Okazaki fragments are named after the Japanese scientist who first discovered them.

The leading strand can be extended by one primer alone, whereas the lagging strand needs a new primer for each of the short Okazaki fragments. The overall direction of the lagging strand will be 3′ to 5′, while that of the leading strand will be 5′ to 3′. The sliding clamp (a ring-shaped protein that binds to the DNA) holds the DNA polymerase in place as it continues to add nucleotides. Topoisomerase prevents the over-winding of the DNA double helix ahead of the replication fork as the DNA is opening up it does so by causing temporary nicks in the DNA helix and then resealing it. As synthesis proceeds, the RNA primers are replaced by DNA. The primers are removed by the exonuclease activity of DNA pol I, while the gaps are filled in by deoxyribonucleotides. The nicks that remain between the newly-synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously-synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase that catalyzes the formation of phosphodiester linkage between the 3′-OH end of one nucleotide and the 5′ phosphate end of the other fragment.

The table summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

Prokaryotic DNA Replication: Enzymes and Their Function: The enzymes involved in prokaryotic DNA replication and their functions are summarized on this table.


DNA Replication - Deep Think Biology 8

A lesson that introduces the mechanism of DNA replication. Students simulate and explore this process by building a paper model that includes DNA polymerase and nucleotides.

'DNA Replication' is a Biology lesson that integrates a four page illustrated and interactive notebook with a thirteen slide PowerPoint with original animated diagrams and answers. Four pages of additional resources, Teacher's Notes and a 'Quick Start Guide' are also included. Students construct their knowledge and understanding of DNA replication by engaging in a range of activities designed to support knowledge acquisition and to promote good thinking skills.

Lesson features include:

Thinking & Learning activities.

All new & original diagrams designed by 'The Natural Scientist'.

Animated PowerPoint slides that fully support each activity (with answers).

Self-evaluation - 'How do I improve?'

Write about topic from different perspectives (completed in class or set as assignment).

Construct a 'Topic-Tree' (lesson activity, assignment or revision task).

Deep Think Biology

'DNA Replication' is the eighth in a series of 'Deep Think Biology' lessons on the Biology of DNA. If you enjoy this lesson please do preview my other lessons in this series. I offer all 8 lessons in a bundle at a substantial discount: $29.99, a saving of over $18 on the list price.

Teaching Philosophy

Presenting information to students is easy, facilitating the development of effective thinking skills is difficult. This ‘DNA Replication’ lesson, like other lessons in the 'Deep Think Biology' series, has been designed to help students acquire such skills whilst immersing them in the exciting science of Biology.

Importantly, Deep Think Biology lessons are designed to enhance your personal pedagogy, not replace it, whilst recognizing and encouraging our role as facilitators.

Interactive Notebook

  • Tasks associated with the ‘Thinking & Learning' section of the interactive notebook form the core of the lesson and are fully supported with PowerPoint slides, printable resources and answers. Students work sequentially through various activities that have been designed to help build confidence and knowledge of the topic always encouraging students to think.
  • During class time, or alternatively set as an assignment, students write about this topic from different perspectives and reconstruct knowledge by building a ‘Topic-Tree’.

PowerPoint Slides

  • Animated diagrams included in PowerPoint slides correspond to those included in the interactive notebook.
  • Integration of PowerPoint slides with the interactive notebook support a combination of teaching styles: from independent work to teacher directed tasks to group and class discussions.

Teacher's Notes

Included in this 'Protein Synthesis' lesson:

If you enjoy this resource please follow The Natural Scientist at TpT and discover a growing collection of quality Biology and Science lessons and resources.


Voir la vidéo: ADN: Hoy presentamos REPLICACIÓN del ADN (Août 2022).