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En PCR, quelle est la composition chimique de l'amorce ? ADN ou ARN ?

En PCR, quelle est la composition chimique de l'amorce ? ADN ou ARN ?



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Je pense que la réponse est l'ARN. Est-ce correct?


Presque toujours de l'ADN. Bien que l'ARN soit possible, il est beaucoup plus difficile à synthétiser (et à maintenir stable) et l'ADN donne un résultat purement ADN qui n'aura pas besoin d'être remplacé par l'ADN plus tard.


Les amorces PCR sont de courts morceaux de ADN simple brin, généralement d'environ 20 nucléotides de long.

Vous pouvez en savoir plus sur la PCR sur Khan Academy ou Wikipedia.


Biologie Moléculaire - Viva Questions - Set -1

Dans les molécules d'ADN, la concentration de nucléotides de désoxyadénosine (A) est égale à celle des nucléotides de thymidine (T) (A = T), tandis que la concentration de nucléotides de désoxyguanosine (G) est égale à celle des nucléotides de désoxycytidine (C) (G = C).

2- Qu'entend-on par hyperchromicité de dénaturation ?

Les doubles liaisons conjuguées des dérivés de purine et de pyrimidine absorbent la lumière ultraviolette. L'effet mutagène de la lumière ultraviolette résulte de son absorption par les nucléotides de l'ADN avec des changements chimiques qui l'accompagnent. Alors que les spectres dépendent du pH, à pH 7,0, tous les nucléotides courants absorbent la lumière à une longueur d'onde proche de 260 nm. Lors de la dénaturation de la molécule d'ADN, il y a une augmentation de l'absorbance optique des bases puriques et pyrimidiques - un phénomène appelé hyperchromie de dénaturation. Dans la forme liée, il y a moins d'absorbance.

3- Définir l'hybridation

La réassociation spécifique de brins complémentaires d'acides nucléiques (ADN avec ADN, ADN avec ARN ou ARN avec ARN) est appelée hybridation.

4-Qu'est-ce qu'une structure en épingle à cheveux ?

Un tronçon en double hélice formé par appariement de bases entre des séquences complémentaires voisines d'un seul brin d'ADN ou d'ARN est désigné par une structure en épingle à cheveux.

5- Quelle est la raison pour laquelle l'information génétique est stockée dans l'ADN et non dans l'ARN ?

L'ADN est une molécule stable par rapport à l'ARN, ne subit pas de dégradation spontanée. Il s'agit donc d'un entrepôt d'informations génétiques et transfère les informations génétiques aux cellules filles avec une précision et une fidélité totales.

6- Quelle est la différence entre l'uridine et la pseudouridine ?

Les deux sont des nucléosides, dans l'uridine, l'uracile est lié au D-ribose par une liaison -N glycosidique, tandis que dans la pseudouridine, l'uracile est lié au D-ribose par une liaison C-C qui n'est pas une véritable liaison.

7-Donnez un exemple d'ADN polymérase dépendante de l'ARN

Transcriptase inverse et télomérase

8-Donnez un exemple d'ADN polymérase dépendante de l'ADN

Toutes les ADN polymérases nécessaires à la réplication

9- Donner un exemple d'ARN polymérase dépendante de l'ADN

ARN polymérase nécessaire à la transcription

10-Définir un modèle

Le modèle est une surface de guidage sur laquelle les molécules sont alignées d'une manière spécifique à la séquence pour former des biomolécules avec un arrangement spécifique et défini de ses composants.

11- L'initiation de la synthèse d'ADN nécessite une amorce (amorçage par une courte longueur d'ARN), quelle en est la raison ?

L'ADN polymérase ne peut pas initier la synthèse de la chaîne, elle peut simplement allonger le fragment existant, c'est pourquoi une amorce est nécessaire. L'ARN polymérase peut initier la synthèse en chaîne, c'est pourquoi les amorces sont toujours constituées d'ARN.

12-Que sont les endonucléases ?

L'endonucléase est une enzyme qui coupe les liaisons internes de l'ADN ou de l'ARN.

13-Quelle est la différence entre exonucléase et exonucléase ?

L'exonucléase est une enzyme qui clive les nucléotides des extrémités 3 & 8242 ou 5 & 8242 de l'ADN ou de l'ARN.

L'exonucléase est tLa nucléase d'excision impliquée dans la réparation par échange de nucléotides de l'ADN.

14- Qu'est-ce qu'un intron ?

Un intron est la séquence d'un gène qui est transcrit mais excisé avant la traduction.

15-Qu'entend-on par ligature ? Nommez l'enzyme responsable de la catalyse de ce processus.

La jonction catalysée par une enzyme de liaisons phosphodiester de deux segments d'ADN ou d'ARN en une seule, les enzymes respectives sont des ADN et ARN ligases.

16. Qu'entend-on par origine de réplication ?

L'origine de la réplication est le site sur l'ADN à partir duquel le processus de réplication commence. Au origine de réplication (ori), il existe une association de protéines de liaison à l'ADNdb spécifiques à une séquence avec une série de séquences d'ADN répétées directes. Chez les procaryotes, il existe une seule origine de réplication tandis que chez les eucaryotes, il existe plusieurs origines en raison de l'énorme longueur de l'ADN.

17- Que sont les séquences palindromes ?

Une séquence d'ADN duplex qui est la même lorsque les deux brins sont lus dans des directions opposées

18-Quelle est la différence entre amorce, primase et Primosome ?

L'amorce est un court fragment d'ARN nécessaire à la réplication de l'ADN. La primase est l'enzyme responsable de la synthèse de l'amorce. C'est un type spécial d'ARN polymérase. Primosome est le complexe mobile d'hélicase et de primase qui est impliqué dans la réplication de l'ADN.

19- Qu'est-ce qu'une sonde ?

Une sonde est une molécule utilisée pour détecter la présence d'un fragment spécifique d'ADN ou d'ARN dans, par exemple, une colonie bactérienne formée à partir d'une bibliothèque génétique ou lors d'une analyse par des techniques de transfert par transfert. Les sondes courantes sont des molécules d'ADNc, des oligodésoxynucléotides synthétiques de définition séquence, ou des anticorps contre des protéines spécifiques.

20-Quelle est la différence entre les gènes constitutifs et inductibles ?

Un gène inductible est celui dont l'expression augmente en réponse à un inducteur ou activateur, un signal régulateur positif spécifique. L'expression de certains gènes est constitutif, ce qui signifie qu'ils sont exprimés à un taux raisonnablement constant et ne sont pas connus pour être soumis à une réglementation. Ceux-ci sont souvent appelés gènes de ménage. À la suite d'une mutation, certains produits géniques inductibles deviennent exprimés de manière constitutive. Une mutation entraînant l'expression constitutive de ce qui était auparavant un gène régulé est appelée un mutation constitutive.

21- Qu'entend-on par pseudogène ?

Un segment inactif d'ADN résultant de la mutation d'un gène parental actif est appelé pseudogène, et en d'autres termes, un pseudogène n'est jamais exprimé pour former un ARN ou une protéine.

22- Qu'est-ce que la transcription inverse ?

C'est la synthèse d'ADN dirigée par l'ARN, catalysée par la transcriptase inverse

23- Qu'entend-on par épissure ?

L'élimination des introns de l'ARN accompagnée de la jonction de ses exons s'appelle l'épissage.

24. Que signifie une molécule chimérique ?

Molécule (par exemple, ADN, ARN, protéine) contenant des séquences dérivées de deux espèces différentes.

25-Qu'est-ce qu'une bibliothèque ?

Une bibliothèque est une collection de fragments clonés qui représente l'ensemble du génome. Les bibliothèques peuvent être soit de l'ADN génomique (dans lequel à la fois les introns et les exons sont représentés) soit de l'ADNc (dans lequel seuls les exons sont représentés).

26-Qu'entend-on par encart ?

Une longueur supplémentaire de paires de bases dans l'ADN, généralement introduite par les techniques de la technologie de l'ADN recombinant, est appelée Insert.

27- Qu'entend-on par ARN Sn ?

Petit ARN nucléaire, Cette famille d'ARN est surtout connue pour son rôle dans le traitement de l'ARNm.

28-Qu'est-ce qu'un Southern Blot ?

C'est une méthode pour transférer l'ADN d'un gel d'agarose à un filtre de nitrocellulose, sur lequel une sonde appropriée peut détecter l'ADN (par exemple, l'ADN ou l'ARN complémentaire).

29-Qu'est-ce que le Northern Blot?

C'est une méthode pour transférer l'ARN d'un gel d'agarose à un filtre de nitrocellulose, sur lequel une sonde appropriée peut détecter l'ARN.

30-Qu'est-ce qu'un western Blot ?

Il s'agit d'une méthode de transfert de protéine vers un filtre de nitrocellulose, sur lequel la protéine peut être détectée par une sonde appropriée (par exemple, un anticorps).

31- Que sont les vecteurs ?

Les plasmides, bactériophages, cosmides, virus ou chromosomes dans lesquels de l'ADN étranger peut être introduit pour le clonage sont appelés vecteurs de clonage.

32- Qu'entend-on par oligonucléotide ?

Il s'agit d'une courte séquence définie de nucléotides (courte portion d'ADN ou d'ARN) réunis dans les liaisons phosphodiester typiques.

33- Qu'est-ce qu'un clone ?

Un grand nombre d'organismes, de cellules ou de molécules qui sont identiques à une seule cellule ou molécule d'un organisme parent

34-Qu'entend-on par Tandem ?

Tandem est utilisé pour décrire plusieurs copies de la même séquence (par exemple, l'ADN) adjacentes les unes aux autres.

35-Qu'entend-on par spliceosome ?

C'est le complexe macromoléculaire responsable de l'épissage de l'ARNm précurseur. Le spliceosome se compose d'au moins cinq petits ARN nucléaires (snRNA U1, U2, U4, U5 et U6) et de nombreuses protéines.

36-Qu'est-ce que l'autoradiographie ?

La détection de molécules radioactives (par exemple, ADN, ARN, protéine) par visualisation de leurs effets sur un film photographique est appelée autoradiographie.

37-Qu'est-ce que la PCR ?

C'est une méthode d'amplification de l'ADN. Il s'agit d'une méthode enzymatique pour la copie répétée (et donc l'amplification) des deux brins d'ADN qui composent une séquence génique particulière.

38- Qu'est-ce que la RT PCR ?

Il s'agit d'une méthode utilisée pour quantifier les niveaux d'ARNm qui repose sur la première étape de la copie de l'ADNc des ARNm catalysée par la transcriptase inverse avant l'amplification et la quantification par PCR.

39-Qu'entend-on par Transcriptome ?

Un transcriptome est l'ensemble des ARNm exprimés dans un organisme.


Comment fonctionne la PCR ?

La PCR imite ce qui se passe dans les cellules lorsque l'ADN est copié (répliqué) avant la division cellulaire, mais elle est réalisée dans des conditions contrôlées en laboratoire. La machine utilisée est simplement appelée machine PCR ou thermocycleur. Des tubes à essai contenant le mélange d'ADN d'intérêt sont placés dans la machine, et la machine modifie la température pour s'adapter à chaque étape du processus.

Les ingrédients standards du mélange sont :

  • le segment d'ADN d'intérêt
  • amorces spécifiques
  • enzyme ADN polymérase résistante à la chaleur
  • les quatre différents types de nucléotides d'ADN
  • les sels nécessaires pour créer un environnement propice à l'action de l'enzyme.

Tests moléculaires SARS-CoV-2 : de la PCR à la LAMP avec un soupçon de CRISPR

Mettre fin à la pandémie de SRAS-CoV-2 / COVID-19 nécessite que nous disposions de tests de diagnostic robustes, de médicaments antiviraux efficaces et d'un vaccin. La ligne de front teste. Comme appris dans le dernier article [1], les tests de diagnostic moléculaire sont le meilleur moyen d'identifier les infections actives au COVID-19, et le nombre de tests disponibles a augmenté à un rythme rapide. Les tests peuvent être effectués par des laboratoires pour leur propre usage, ou par des entreprises pour être utilisés dans de nombreux laboratoires.

Lorsque les entreprises effectuent un test pour la distribution, la possibilité de distribuer et de vendre leurs tests est contrôlée par la Food and Drug Administration des États-Unis (FDA). Dans une crise, comme celle que nous vivons, la FDA offre un moyen rapide d'approuver les tests pour une période limitée. Ce processus d'approbation, l'autorisation d'utilisation d'urgence (EUA), réduit le fardeau de la validation. Entre la mi-mars et le début du mois de mai, 55 EUA de diagnostic moléculaire ont été accordées et d'autres sont accordées quotidiennement. Certains tests fonctionnent bien, d'autres moins bien [2]. Les tests utilisent une grande variété de méthodes, mais comment fonctionnent-ils ?

Pour répondre à la question de savoir comment fonctionnent-ils, nous avons développé un bref historique des diagnostics moléculaires (tests) infographique (à droite) et un blog plus long que d'habitude pour expliquer les panneaux (ci-dessous).

PCR - La réaction en chaîne par polymérase fournit la base

Presque tous les tests moléculaires nécessitent une étape d'amplification de l'ADN. Cela se fait généralement par PCR (Polymerase Chain Reaction). La PCR a changé la donne en biologie moléculaire [3], car elle nous a permis d'identifier des molécules d'ADN présentes en trop faible concentration pour être détectées par des moyens conventionnels. La PCR augmente la concentration d'ADN en copiant des millions et des millions de molécules d'ADN d'une manière spécifique à la séquence permettant de voir l'invisible.

La PCR a été rendue possible grâce à deux concepts génétiques fondamentaux, deux avancées technologiques et quelques mathématiques.

Concept génétique un : Les bases qui composent l'ADN et l'ARN (acides nucléiques) sont ordonnées de 5' à 3' et forment des doubles brins antiparallèles dans un ordre spécifique à la séquence par le biais de liaisons hydrogène. A (adénine) s'apparie avec T (thymine) et C (cytosine) s'apparie avec G (guanine). Dans l'ARN, U (uracile) remplace T. Les bases complémentaires s'apparient par des liaisons hydrogène faibles, mais coopératives. La force de l'interaction est proportionnelle au nombre de liaisons hydrogène. Lorsqu'ils sont appariés, A et T forment deux liaisons hydrogène et C et G en forment trois, de sorte que les paires de bases CG sont plus fortes que les paires de bases AT (ou AU). Au fur et à mesure que de plus en plus de bases sont impliquées dans l'appariement via des brins plus longs, les brins se tiennent plus étroitement. La formation de paires de bases est appelée hybridation ou annelage.

Comme les liaisons hydrogène sont des liaisons faibles, l'appariement des bases peut être perturbé par la chaleur et d'autres facteurs. C'est-à-dire qu'à une certaine température, une molécule d'ADN double brin (ADNdb) peut "fondre" en molécules séparées simple brin (ADNsb). La température de fusion (Tm) est fonction du nombre et des types de paires de bases (AT, AU ou GC). Tm définit un état où la moitié des molécules sont hybridées et la moitié ne le sont pas. Au niveau moléculaire, les états dsDNA et ssDNA changent rapidement, comme la respiration. En plus de la chaleur, les produits chimiques, les protéines et la concurrence d'autres molécules d'ADN simple brin peuvent perturber l'appariement des bases. Les molécules d'ADN et d'ARN peuvent également former des doubles brins intramoléculaires où les régions locales d'une séquence se replient pour former des structures tige-boucle.

Ainsi, le premier concept de la PCR est que les acides nucléiques "trouvent" d'autres acides nucléiques et forment des hybrides en solution par appariement de bases complémentaires (hybridation). L'hybridation repose sur des liaisons hydrogène faibles. La formation et la fusion des régions double brin sont dynamiques et sont contrôlées par la température et d'autres facteurs.

Concept génétique deux : L'ADN et l'ARN peuvent être copiés selon une matrice dirigée par des enzymes appelées polymérases. Les polymérases ajoutent des bases à un brin d'acide nucléique par une réaction qui combine un nouveau nucléoside triphosphate avec un 3'-OH libre (groupe hydroxyle) sur un brin d'ADN ou d'ARN existant. Les règles d'appariement des bases et la séquence de la matrice d'acide nucléique déterminent quel nucléoside triphosphate est ajouté. Les T (U) sont ajoutés en face des A, les C sont ajoutés en face des G, et vice versa. En bref, les polymérases lisent un modèle pour écrire une séquence complémentaire à ce modèle.

Avancement technique un : la découverte de la Taq polymérase [4]. Brièvement, Taq (Thermus aquatique) est une bactérie qui se développe dans les sources chaudes du parc national de Yellowstone. Parce qu'il pousse à haute température, ses enzymes peuvent tolérer une chaleur élevée, proche de l'ébullition. A de telles températures, les molécules d'ADN hybridées, de n'importe quelle longueur, fondent souvent en molécules simple brin, à moins qu'elles ne soient protégées par une protéine.

Avancement technique deux : la capacité de synthétiser chimiquement l'ADN de manière automatisée [5]. D'en haut, les polymérases « lisent » une matrice pour ajouter des bases complémentaires à un groupe 3'-OH. En d'autres termes, les réactions d'addition de bases doivent être amorcées. C'est pourquoi certains ADN synthétiques sont appelés amorces. Un fragment d'ADN s'hybride à une matrice d'ADN et la polymérase forme un complexe qui peut lire la matrice et ajouter des bases. La synthèse chimique automatisée de l'ADN a permis de fabriquer de nouvelles molécules d'ADN à partir de séquences d'ADN à grande échelle. Ainsi, n'importe quel ADN peut être copié à partir de n'importe quel environnement si nous connaissons sa séquence.

Quelques maths : En PCR, CR signifie réaction en chaîne. Une réaction en chaîne peut se produire car chaque brin d'ADN peut être copié en brins complémentaires, doublant le nombre de molécules d'ADN à chaque cycle de chauffage (fusion), d'amorçage (hybridation) et de copie (polymérisation). L'augmentation géométrique (2 n ) donne environ 1000 fois plus d'ADN que la quantité initiale, après 10 cycles, un million de fois plus après 20 cycles et un milliard de fois plus après 30 cycles. Chaque cycle de chauffage, de refroidissement et d'autres réglages prend environ 5 minutes nous y reviendrons plus tard.

RT-PCR - Reverse Transcriptase PCR, détecte l'ARN en le convertissant en ADN

La PCR est idéale pour identifier des molécules d'ADN spécifiques. Et l'ARN ? De nombreux virus, dont le SARS-CoV-2, utilisent l'ARN comme matériel génétique. Dans la nature, l'ADN est copié (transcrit) en ARN au fur et à mesure que les gènes sont exprimés. L'ARN peut également être copié en ADN par transcription inverse. L'enzyme, la transcriptase inverse, découverte dans les rétrovirus [6] (un autre type de virus à ARN), permet de copier de l'ARN en ADN en laboratoire. Il suffit d'amorcer la réaction avec une amorce d'ADN. La RT-PCR (reverse transcriptase PCR) comporte donc deux étapes : 1. Convertir l'ARN en ADN 2. Utiliser la PCR pour amplifier l'ADN souhaité. Il est possible de combiner ces étapes dans un seul tube de réaction.

RT-PCR - PCR en temps réel, mesure initiale [ADN] en couplant l'amplification et la détection

La PCR et la RT-PCR permettent de détecter de très petites quantités d'ADN ou d'ARN dans des échantillons de cheveux, de morceaux d'os, d'écouvillons du nez et de la gorge, de gouttes de sang, d'urine, d'excréments, de surfaces et d'autres sources. Dans certaines applications, nous avons besoin de savoir quelle quantité d'ADN ou d'ARN est détectée. Par exemple, pour voir si le nombre de virions augmente. Dans ces cas, la PCR doit être quantitative. Si nous pouvions coupler la capacité de mesurer le nombre de mesure de la concentration d'ADN (notée [ADN]) avec le nombre de cycles de PCR, en temps réel, nous pourrions utiliser la croissance relative de l'intensité du signal pour déduire le nombre de molécules d'ADN initiales qui sont étant copié. Le principe de base de la RT-PCR (également exprimée en qPCR, nous ne la confondons donc pas avec la RT-PCR ci-dessus) est qu'il faut moins de cycles de PCR pour amplifier un plus grand nombre de molécules et atteindre un certain nombre. Un échantillon avec deux fois plus de molécules qu'un autre a un cycle complet d'avance dans le doublement de ses molécules. Cette tendance peut être observée en traçant l'intensité du signal par rapport au nombre de cycles pour chaque échantillon.

Pour être quantitatifs, les signaux entre les échantillons doivent être comparés pendant la phase logarithmique de la croissance [ADN], et également être comparés à des échantillons témoins avec un [ADN] connu. Bien que la quantité d'ADN double à chaque cycle, elle ne le fait pas pour toujours. La dénaturation enzymatique, l'accumulation de sous-produits de réaction et d'autres problèmes limitent pratiquement le nombre de cycles au cours desquels [l'ADN] double. Ce plafond produit les courbes S qui sont observées lorsque les signaux sont tracés en fonction du nombre de cycles.

Alors, comment faisons-nous ces signaux ?

Colorants intercalants : Il existe de nombreuses façons de mesurer la concentration d'ADN. Une approche consiste à utiliser un colorant fluorescent, comme le vert SYBR, qui devient plus fluorescent lorsqu'il se lie à l'ADN double brin. Le vert SYBR se lie à l'ADN par intercalation, un processus au cours duquel les molécules de colorant glissent entre les bases de l'ADN. Lorsque les colorants intercalants se lient à l'ADN, ils se déplacent dans un environnement hydrophobe qui élimine l'eau qui, autrement, étoufferait leur signal fluorescent. L'intercalation augmente l'intensité du signal du colorant (1000 fois pour le vert SYBR). Ainsi, à mesure que [dsDNA] augmente, la valeur de fluorescence de l'échantillon augmente également.

Sondes : Un problème avec les colorants intercalaires est qu'ils ne sont pas spécifiques. Ils se lient à n'importe quel ADNdb. Rappelons que la seule règle pour une polymérase est une matrice et un 3'-OH libre. Quelques bases peuvent servir d'amorce. Par conséquent, la PCR peut avoir des artefacts provenant du repliement de l'ADN sur lui-même aux amorces s'auto-hybridant (dimères d'amorces) ou s'hybridant à d'autres séquences. Une fois copiés, les artefacts peuvent être copiés davantage et augmenter le bruit du test. Si nous avons un moyen de faire la distinction entre les artefacts d'analyse d'amplification d'ADN spécifiques et non spécifiques, ils seraient réduits. Les sondes, des ADN synthétiques conçus pour s'hybrider à des séquences spécifiques au sein d'une cible souhaitée (un site interne aux amorces), sont un moyen de limiter la mesure aux molécules que nous voulons mesurer.

Deux exemples de sondes couramment utilisées sont Sondes TaqMan et balises moléculaires. Oui, TaqMan porte le nom de PacMan, en partie parce que nous aimons dessiner des enzymes comme PacMan. Taq rime également avec Pac et, comme les ADN polymérases mangent également de l'ADN (5'-exonucléase) dans le cadre de la correction d'erreurs, TaqMan devient à propos. TaqMan et les balises moléculaires ont la propriété que la valeur de fluorescence augmente en fonction de [l'ADN]. Mais, la façon dont la fluorescence est générée dans ces tests est basée sur deux mécanismes très différents.

Dans les deux tests, l'extinction de la fluorescence est utilisée pour supprimer le signal des sondes non liées. Comme indiqué ci-dessus, l'extinction peut être non spécifique, telle que l'extinction à l'eau de la fluorescence des colorants intercalants. L'extinction peut également se produire par une interaction moléculaire spécifique où une molécule d'extinction absorbe la lumière émise par une molécule fluorescente (un fluor). Dans ce dernier cas, le fluor et son extincteur doivent être à proximité immédiate.

Les sondes TaqMan reposent sur l'activité 5'-exonucléase des ADN polymérases. Le fluor et son extincteur sont tous deux attachés à une sonde. Si la sonde est liée à sa cible d'ADN ou libre en solution, le fluor est désactivé. Lorsque les peuplements d'ADN cible sont fondus pendant la phase thermique de PCR, la sonde TaqMan s'hybride à sa séquence cible interne. Lorsque l'ADN polymérase copie le nouvel ADN, elle digère la sonde liée (via la 5'-exonucléase) et libère le fluor, produisant un signal. La quantité de fluor libéré (signal) correspond à [ADN].

Les balises moléculaires fonctionnent de manière opposée. Ils sont construits de telle sorte que l'ADN synthétique forme une structure tige-boucle avec la séquence d'ADN sonde contenue dans la boucle. À l'état non lié, la tige se forme pour maintenir l'extincteur près du fluor. Lorsque la sonde s'hybride à sa cible d'ADN, la tige fond, car le nombre de bases de sonde est supérieur au nombre de bases de tige, de sorte qu'elle forme une interaction plus forte. Le signal est produit lorsque le fluor et l'extincteur s'éloignent suffisamment l'un de l'autre. Alors que la sonde sera déplacée au fur et à mesure que l'ADN est copié, elle est hybridée suffisamment longtemps pour mesurer un signal.

PCR numérique - Augmentez la précision en effectuant des réactions individuelles

Chaque cycle de PCR quantitative mesure un doublement de la concentration d'ADN. Il existe de nombreux exemples dans l'analyse génétique et l'expression des gènes où nous voulons compter le nombre de molécules d'acide nucléique initiales avec une plus grande précision. Parce que nous ne pouvons pas simplement compter les molécules, nous avons besoin d'un moyen d'inférer la valeur de départ. Cela se fait généralement en préparant une dilution limite.

La dilution limite est un processus où un échantillon est dilué au point où un récipient est susceptible de contenir une seule molécule. Par exemple, si j'ai trois molécules et que mon récipient contient un microlitre, alors la dilution de mon échantillon neuf fois me donnera trois molécules dans neuf microlitres. S'ils sont divisés en neuf conteneurs, six auront zéro molécule et trois auront une molécule. Parfois, un conteneur aura deux molécules. Lorsque chaque conteneur contient une molécule, nous pouvons exécuter autant de cycles PCR que nécessaire pour obtenir un bon signal, et simplement compter les chambres positives et négatives pour obtenir une sortie binaire 1 ou 0 (numérique).

Avec l'avènement de la micro-fluidique et des méthodes d'émersion d'huile, nous pouvons fabriquer des conteneurs à partir de très petites gouttes d'eau. Chaque goutte contient soit une molécule d'ADN, soit rien en raison de dilutions limites. Les réactions PCR sont exécutées sur un certain nombre de cycles à l'aide de sondes TaqMan ou de balises moléculaires. Une fois les réactions terminées, les gouttes s'écoulent, en file indienne, à travers un capillaire qui est attaché à une source lumineuse et à un détecteur pour mesurer le signal. Les nombres de gouttes positives sont comptés et comparés entre les échantillons.

La PCR numérique nous donne également de nouveaux acronymes. Dans ce cas, dPCR signifie digital PCR et ddPCR signifie digital droplet PCR. dPCR et ddPCR signifient essentiellement la même chose, mais, comme la PCR est une grande entreprise, les termes sont utilisés de manière interchangeable pour l'image de marque.

PCR isotherme - Lumière sous la LAMPE

La PCR nécessite des cycles de chauffage, de refroidissement et d'autres ajustements. Chaque cycle nécessite environ cinq minutes avec un équipement standard, et le processus de test complet (de l'échantillon au résultat) peut prendre quatre heures ou plus. Les temps de cycle peuvent être raccourcis en utilisant des dispositifs microfluidiques spécialisés qui utilisent de minuscules "tuyaux" pour faire circuler les réactions à travers des gradients de température. Si les cycles de PCR pouvaient être exécutés à une température constante qui optimisait le "dynamisme" de l'hybridation, de la fusion et de l'activité enzymatique, l'amplification de l'ADN pourrait se dérouler rapidement avec des concentrations augmentant significativement plus rapidement que les taux de doublement de la PCR, car il n'y aurait pas "d'arrêts". Ce procédé, appelé amplification isotherme, n'est plus de la PCR, car il n'y a pas de réaction en chaîne, juste une amplification massive. Le test de 13 minutes développé par Abbot Laboratories qui a été utilisé à la Maison Blanche est un test d'amplification isotherme avec des sondes de balise moléculaire [2].

Il existe de nombreux types d'amplification isotherme. Par exemple, Loop-mediated AMPlification (LAMP) gagne en popularité. Les tests LAMP nécessitent quatre amorces et six sites cibles (voir infographie). Deux des amorces (F2, R2c) ont des adaptateurs (régions de séquences sur une amorce qui améliorent divers processus) avec des séquences (F1c, R1) qui sont complémentaires des sites (F1c, R1) au sein de l'ADN cible. Dans une phase ultérieure de la réaction, ces adaptateurs s'hybrident avec ces sites pour former des structures tige-boucle au sein de la cible. Deux autres amorces (F3, R3c) complémentaires des sites terminaux (F3c, R3) de la cible sont utilisées pour amplifier la cible d'origine, comme la PCR.

Lorsque les réactifs, les amorces, les nucléotides, l'enzyme (avec des propriétés de déplacement de brin) et d'autres composants sont mélangés à l'ADN de l'échantillon et que la température de réaction est réglée, toutes sortes de synthèses d'ADN se produisent, en même temps, et s'exécutent dans un processus continu. Nous dessinons l'image en trois étapes, afin que nous puissions la comprendre, mais c'est toujours déroutant. Alors, j'aime regarder cette vidéo [11].

Dans la première étape, les amorces F2 et R2c s'hybrident aux sites cibles intermédiaires (F2c, R2). La polymérisation résultante produit des molécules d'ADN avec des extrémités (F1c, R1) qui peuvent former des structures tige-boucle avec les sites F1 et R1c nouvellement synthétisés. Ensuite, les amorces F3 et R3c s'hybrident aux sites terminaux (F3c, R3) et amorcent les synthèses des brins cibles d'origine, qui sont maintenant disponibles pour la première étape. Dans la troisième étape, la région tige-boucle se forme en ajoutant une extrémité 3'-OH supplémentaire qui est utilisée pour initier davantage de synthèse d'ADN. D'autres amorces peuvent également s'hybrider pour répéter les cycles de synthèse, de bouclage et de synthèse. En quelques minutes, suffisamment d'ADN est copié pour le rendre facilement détecté. La détection peut être réalisée comme en qPCR par fluorescence ou par dosages colorimétriques (non discutés).

Un avantage de LAMP est la courte durée de dosage. Une autre est que la méthode peut être utilisée en dehors du laboratoire dans des formats dits de point de service (POC) ou de point de besoin (PON).

Une PCR CRISPR

Les tests moléculaires évoluent et s'améliorent continuellement. Les enzymes CRISPR sont un ajout récent à la boîte à outils des tests moléculaires [12]. Les systèmes CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sont une forme de système immunitaire adaptatif utilisé par les bactéries qui combinent des unités d'acide nucléique CRISPR avec une enzyme coupante d'ADN (ou d'ARN) (Cas). Lorsque le complexe CRISPR/Cas se lie aux acides nucléiques du phage étranger (virus bactérien), via l'hybridation, l'enzyme Cas coupe les acides nucléiques de l'envahisseur [13]. Dans le diagnostic moléculaire, le système CRISPR est utilisé pour augmenter la spécificité du test et produire des signaux fluorescents lorsque des séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques sont détectées.

Le test COVID-19 actuel – Sherlock (déverrouillage enzymatique spécifique de journaliste à haute sensibilité [12]) CRISPR SARS-CoV-2 – comporte deux étapes. La première étape combine la transcriptase inverse et la LAMP pour amplifier l'ADN. Certaines des amorces LAMP comprennent des adaptateurs qui contiennent des séquences de promoteur d'ARN polymérase T7 qui sont utilisées dans la deuxième étape. Dans cette étape, les séquences cibles d'ARN sont produites par l'ARN polymérase T7. Au fur et à mesure que ces molécules d'ARN sont fabriquées, elles peuvent se lier à une enzyme Cas13 (l'une des nombreuses nucléases CRISPR [14]) qui comprend une sonde contenant une séquence de type CRISPR qui contient une région complémentaire de la séquence cible. Lorsque la sonde se lie à sa cible, l'enzyme Cas13 coupe et libère la cible. Cette coupure stimule une activité supplémentaire de nucléase non spécifique (coupe d'ADN) qui clive les molécules d'ADN synthétique de type TaqMan libérant un fluor de son extincteur et produisant un signal (l'étape de déverrouillage du rapporteur enzymatique de Sherlock). Dans le test CRISPR, le signal est général, mais est le résultat d'une interaction moléculaire dépendante de la séquence hautement spécifique.

55 EUA de la FDA montrent une grande diversité dans les tests moléculaires SARS-CoV-2/COVID-19

Les tests de diagnostic moléculaire COVID-19 actuels sont divers et non sans controverse [1]. Chacune des méthodes ci-dessus est utilisée d'une manière ou d'une autre dans au moins un test, sinon je n'aurais pas passé autant de temps à couvrir les différents formats de test. En effet, nous pouvons apprendre beaucoup des fichiers PDF des instructions d'utilisation de l'EUA (IFU), ou résumé de l'EUA, qui sont publiés par la FDA [15]. Chaque fichier contient des informations sur le format du test, comment exécuter le test et d'autres données (limites des performances de détection avec les contrôles), avec la mise en garde qu'il existe un mélange de méthodes bien divulguées et de descriptions de boîte noire où le fabricant ne voulait pas révéler techniques propriétaires. Tous les formats de description sont différents et rapportent des données critiques de plusieurs manières, il est donc difficile d'analyser systématiquement les rapports. Mais, nous pouvons apprendre quelque chose des mots clés.

J'ai utilisé deux méthodes pour analyser les mots clés dans les EUA. La première consistait à examiner les termes « PCR ». Beaucoup, PCR, RT-PCR, RT-qPCR, RTqPCR, ddPCR, RT-ddPCR, rRT-PCR, dPCR, RT-dPCR, QPCR, micPCR et RealPCR ont été trouvés dans un ou plusieurs documents. Quelques documents EUA ne contenaient pas de terme PCR, car ils utilisent des méthodes isothermes pour amplifier l'ADN cible. Tous les tests utilisent la transcriptase inverse, qu'ils le disent ou non. Pour trouver les termes PCR et compter le nombre de tests utilisant un terme, j'ai écrit un script Python qui utilisait la bibliothèque Natural Language Tool Kit (NLTK) et les bibliothèques Python pdf pour extraire tous les mots uniques de chaque document. J'ai exécuté ce script sur un répertoire de fichiers (tous les IFU/Résumés EUA) et j'ai redirigé la sortie vers grep "PCR" et produit une liste de tous les termes de PCR. Chaque terme, répertorié par document, a été compté pour répertorier le terme et le nombre de documents dans lesquels il apparaît à l'aide d'un simple script de "compte de mots". Cette liste a été modifiée manuellement pour supprimer divers termes "fragments" résultant de tirets dans les noms. La dernière étape consistait à créer un nuage de mots [16] pour l'infographie.

Les termes PCR seuls fournissent peu de détails. Pour en savoir plus sur les technologies spécifiques utilisées, des recherches de mots ont été effectuées dans DEVONThink [17]. Tout d'abord, j'ai utilisé les termes TaqMan, balise, CRISPR, isotherme, numérique et TaqPath indépendamment pour identifier le nombre d'EUA contenant ce terme particulier. Plus de la moitié des documents utilisaient au moins un des termes. Ensuite, des requêtes "et non" (!TaqMan & !beacon & !CRISPR & !isotherme & !digital &!TaqPath) ont été testées. La lecture des 23 documents restants a identifié des mots tels que "exonucléase", "dégrade" (comme dans la polymérase dégrade la sonde) et "dégradé" que j'ai ensuite inclus dans les recherches et utilisés pour déduire les formats de test. L'ajout de !exonucléase & !dégrade & ! dégradé à la liste des termes "& not", a laissé 12 documents. Parmi ces documents restants, quelques inférences supplémentaires ont pu être faites, mais cinq documents étaient encore trop opaques et ont donc été classés comme non définis. J'ai tracé les données résultantes dans le camembert infographique pour montrer la diversité des méthodes.

Depuis la découverte de la PCR il y a près de 40 ans, la technologie a évolué à bien des égards. La RT-PCR est une méthode prédominante dans les tests de diagnostic moléculaire et, comme en témoigne la liste croissante de tests SARS-CoV-2 disponibles, les concepts et composants de PCR sont continuellement affinés et développés à mesure que l'industrie recherche de nouveaux tests, plus rapides et plus sensibles. , more specific, and easier to run formats. Of course, technology alone does not win. As recently noted in the news, the tests must also be run correctly [2] with good controls. We'll save that discussion for another post.

Notes and References

2. U.S. Regulator Is Reviewing Abbott's Fast COVID Test After Studies Raise Accuracy Concerns, NY Times (By Reuters, May 14, 2020).
Abbott Laboratories' ID Now COVID-19 - https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.11.089896v1.full.pdf

3. The discover of PCR by Kary Mullis in 1983 led to one half of a 1993 Nobel prize in chemistry, the other half went to Micheal Smith for site directed mutagenesis, which is enabled by PCR. See https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/summary/ for more.

5. Caruthers MH. The chemical synthesis of DNA/RNA: our gift to science. J Biol Chem. 2013 Jan 11288(2):1420-7. doi: 10.1074/jbc.X112.442855. PubMed Central PMCID: PMC3543024.

6. Coffin JM, Fan H. The Discovery of Reverse Transcriptase. Annu Rev Virol. 2016 Sep 293(1):29-51. PubMed PMID: 27482900.

7. Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions (1993)

8. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Génome Res. 1996 Oct6(10):986-94. PubMed PMID: 8908518.

9. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization (1996)

12. SHERLOCK: Nucleic acid detection with CRISPR nucleases

17. DEVONThink and a software application that stores PDF files, web pages and other documents in a searchable database - available at https://www.devontechnologies.com/

Remerciements: This work was supported in part by the "START Immuno Biotech" NSF grant (DUE 1700441, Shoreline Community College). Dr. Sandra Porter (Digital World Biology) provided helpful comments and edits.


How to Design PCR Primers

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Polymerase Chain Reaction (PCR) is a technique that has various applications in research, medical, and forensic field. It amplifies the DNA fragment of interest. It is also a sensitive test for disease diagnosis and genotyping. The basic ingredients of a reaction system include a DNA template, a buffer solution, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs), Taq polymerase, and a pair of primers (the forward one and the reverse one). Properly designed primers reduce the cost and time spent on experimentation. Primer-BLAST is a powerful tool to find the primers specific to a template. This tool is free to use and does not require software installation or programming skills. This article demonstrates how to design PCR primers with an example of Primer-BLAST.


The principle of real-time PCR:

The principle of real-time PCR relies on the use of fluorescent dye. In general, the principle of the present method is stated below,

“The amount of the nucleic acid present into the sample is quantified using the fluorescent dye or using the fluorescent labeled oligos.”

Two types of chemistry are available for the real-time quantitative PCR:

  1. DNA binding dye (Intercalating dye-based method)
  2. Sequence-specific probe ( Hydrolysis Probe-based detection method)

How can we decide which method is used for which types of a real-time experiment?

Or can we use both methods for all the samples?

  • What types of experiments we want to perform.
  • The overall cost or the budget of our sample.
  • The knowledge and expertise of the researcher and
  • The tissue type of the sample.

Guanidine Thiocyanate

Guanidine Thiocyanate (Guanidinium thiocyanate or guanidinium isothiocyanate), a powerful protein denaturant, is most often used to inactivate endogenous RNases in the isolation of RNA from various tissues and bacteria. When used with acid-equilibrated phenol or phenol:chloroform, a solution of Guanidine Thiocyanate and beta-mercaptoethanol are very effective in disrupting both cytoplasmic and nuclear membranes while maintaining the integrity of the RNA. In addition, Guanidine Thiocyanate is also used as a storage buffer for blood samples.

*: Prices are for customers in Canada and USA only.


Asymptomatic carrier:

“The asymptomatic carrier for the disease are the intermediate organisms who are infected with the pathogen and do not show symptoms of infection but it can transmit it to other organisms.”

Also known as a “carrier for infection”, pets and animals near to humans like cows, buffalo or pigs are considered as an asymptomatic carrier for so many infections.

In the case of coronavirus, initially, bats were considered as asymptomatic carriers. Then later, scientists found that not bats but pangolin, smuggled from other countries were the asymptomatic carrier of the infection.

Interestingly, previous research indicated that other animals like camels, cats, or bats show the symptoms of the disease as humans. Even though the virus was spread through the intermediate animal hosts, calling them asymptomatic carriers is scientifically not true.

We can say these animals might be the source of infection but are not a carrier.

In another case, children below the age of 12 are considered as carriers. If we analyze the data of coronavirus infection, infected child patients below the age of 12 are less. Therefore, it is presumed that they might be infected but don’t show signs or symptoms.

The infected patient below the age of 12 was also reported in China. No scientific evidence in support of the present assumption is reported to date. Conclusively, neither animals nor children below 12 can be considered as an asymptomatic carrier for infection.


Function of different DNA regions

Not all DNA has the same purpose. There are lots of ways to characterise the difference in function between different regions, but one broad distinction is between that of coding sequences and DNA which is non- coding .

Coding sequences

DNA is called 'coding' if it contributes to the mRNA sequence that will be read by the translation machinery to produce proteins. Coding sequences are found within genes in the form of exons. In some organisms such as humans, the percentage of the genome which consists of coding sequences can be less than 10%. Whilst only representing a small amount of total genetic content, changes in coding sequences – by mutation or genetic engineering – often have a larger effect on cells as they change the structure a protein.

Non-coding DNA

Non-coding DNA refers to sequences that do not contribute directly to protein formation via transcription and translation. These non-coding sequences can have a huge variety of roles:

Regulatory elements: These are DNA sequences which help control the expression of specific genes. Regulatory elements include promoters , which lie just upstream of the coding sequences of genes as well as enhancers , which can be much further away from the genes they control (sometimes as far as 1Mb away).

Introns: Coding sequences within genes are often not present in a single continuous stretch. Instead, different coding sequences that contribute to the same protein are split apart by sequences of non-coding DNA called introns. Through a process called splicing , the coding sequences (exons) of mRNA are stitched together and the introns separating them are removed.


GenScript Press Release about COVID-19

  • Forbes article on Synthetic Bio Companies Racing to Fight Coronavirus here
  • Reuters article: Countries rush to build diagnostic capacity as coronavirus spreads
  • Genetic Engineering & Biotechnology News: Detecting Coronavirus Cases as Outbreak Grows here
  • GenScript is mentioned in a Coronavirus story mostly about Novacyt that was written by Reuters, but picked up by The New York Times here today
  • Medical Device & Diagnostics Online article here
  • LabPulse article here
  • GenomeWeb article here
  • Biospace Blog: China Coronavirus Update: Continued Spread, Run on Antivirals and Facemasks, Baby Diagnosed

To place order or need technical support for coronavirus detection assay, please contact:


Voir la vidéo: La Réplication de LADN 33: Le Remplacement des amorces dARN (Août 2022).