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L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ?

L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ?



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Y a-t-il une raison pour laquelle l'huile (par exemple, végétale ou minérale claire) n'est pas utilisée pour faire des montages humides en microscopie ? Je ne fais pas référence à la technique d'immersion dans l'huile, mais à la substitution de l'huile à l'eau dans des montages humides en microscopie à fond clair.

La question porte principalement sur la mousse ou la moisissure, des choses qui ressemblent à des plantes sur une diapositive. Les propriétés optiques peuvent être bonnes et la viscosité, comme pour la glycérine, donne un peu de profondeur à la lame. Peut-être que cela provoque une sorte de distorsion? Je ne vois pas cela comme une suggestion sur les sites de microscopie.

Merci.


Généralement, des montages humides sont utilisés pour observer la mobilité et le comportement des micro-organismes. Une utilisation classique pour une monture humide serait d'étudier quelque chose comme l'eau d'un étang où vous pourriez voir tous les différents organismes nager comme ils le feraient dans leur environnement naturel. Les huiles sont plus visqueuses et entraveraient la mobilité et pourraient avoir un impact sur le comportement ou même être toxiques pour les micro-organismes.

Si vous étiez un fabricant d'huile d'olive et que vous pensiez avoir une contamination microbienne étrange de votre huile d'olive, vous pourriez regarder une goutte de votre huile d'olive entre une lame et une lamelle en utilisant ainsi un support humide à base d'huile comme vous le décrivez. Vous pourriez également le faire si vous étudiiez la microbiologie d'un déversement de pétrole dans l'eau.

Rien ne dit que vous ne pouvez pas suspendre un échantillon dans de l'huile. Il peut même y avoir un avantage inconnu à utiliser cette méthode dans certaines circonstances, qui attend d'être découvert.


Microscopie à immersion dans l'huile

Lorsque la lumière passe d'un matériau d'un indice de réfraction à un matériau d'un autre, comme du verre à l'air ou de l'air au verre, elle se courbe. La lumière de différentes longueurs d'onde se plie à différents angles, de sorte qu'à mesure que les objets sont agrandis, les images deviennent de moins en moins distinctes. Avec les objectifs "dry", cette perte de résolution empêche d'utiliser des grossissements supérieurs à 400x ou plus. En fait, comme vous le verrez plus tard, même à 400x les images de très petits objets sont fortement déformées.

La microscopie à immersion dans l'huile est essentielle à tout laboratoire de microbiologie. Des frottis colorés de bactéries mixtes sont recommandés pour la pratique.


L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ? - La biologie

La préparation des lames de microscope n'est pas trop compliquée et peut être effectuée facilement avec un peu de connaissances. Les deux types de techniques de préparation de lames de microscope comprennent les lames à montage sec et les lames à montage humide.

Lames de microscope à montage à sec

Les lames à montage à sec nécessitent une lame de microscope en verre vierge, une lamelle de protection en verre et un échantillon sans humidité. Des exemples de diapositives montées à sec comprennent des pattes d'insectes, des pétales de fleurs, des poudres ou des substances telles que des grains de sable ou des produits chimiques secs, des échantillons de saleté et même du papier journal.

Lors de la préparation d'une lame à montage sec, placez l'échantillon entre la lame de microscope en verre et la lamelle. Appuyez fermement sur la lamelle pour aplatir l'échantillon. Lors de l'utilisation d'un microscope à haute puissance, si l'échantillon n'est pas plat, il ne sera pas entièrement mis au point, en particulier à des grossissements plus élevés.

Puceron capturé à un grossissement de 100x. (Exemple d'une diapositive montée à sec).

Lames de microscope à montage humide

Les lames humides sont utilisées pour visualiser les liquides au microscope. La préparation d'une lame à montage humide comprend une lame à dépression, une lamelle et un compte-gouttes peut être utile, mais n'est pas obligatoire. Les échantillons de lames à montage humide peuvent inclure des échantillons d'eau d'étang, de cellules de joue, de sang ou de sperme.

Lors de la préparation de la lame à montage humide, placez une petite goutte de l'échantillon entre la lame à dépression et la lamelle. Utilisez une serviette en papier lorsque vous appuyez la lamelle sur la lame, car une partie de votre échantillon pourrait déborder des bords. Si vous souhaitez créer une diapositive permanente, vous pouvez recouvrir les bords de votre lamelle de vernis à ongles transparent. Cela vous permettra de le fixer de façon permanente à la glissière, en verrouillant l'humidité dans la chambre que vous créez entre la glissière à dépression et la lamelle. Si vous rendez votre lame permanente, assurez-vous de sceller tout le bord de votre lamelle afin que l'échantillon ne s'évapore pas avec le temps.


L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ? - La biologie

Le microscope est absolument essentiel au laboratoire de microbiologie : la plupart des micro-organismes ne peuvent être vus sans l'aide d'un microscope, à l'exception de certains champignons. Et, bien sûr, il y a des microbes qui ne peuvent pas être vus même avec un microscope, à moins qu'il ne s'agisse d'un microscope électronique, comme les virus.

Vous utiliserez un microscope optique assigné pour une variété d'exercices de laboratoire tout au long du semestre, de l'observation de l'eau du bassin à l'identification de votre bactérie inconnue. Par conséquent, il est extrêmement important que vous compreniez comment utiliser efficacement le microscope et comment utiliser différents types de microscopie—-champ lumineux, contraste de phase, et terrain sombre. Les microscopies à contraste de phase et sur fond noir sont utilisées pour les montages humides, tandis que le fond clair peut être utilisé pour les montages humides et les échantillons colorés.

Vous obtiendrez également votre première exposition à la préparation d'un frottis bactérien et à sa coloration ultérieure. Cependant, vous faites une tache simple, en utilisant un seul colorant. Tout sur la diapositive sera de la même couleur, mais vous pouvez distinguer les formes, les tailles et les arrangements de bactéries.

LES MATÉRIAUX NÉCESSAIRES

  • microscope
  • l'eau de l'étang
  • lames de microscope
  • lamelles
  • compte-gouttes d'huile
  • diapositives préparées de Bacille
  • cure-dents
  • kits de teinture

LES PROCÉDURES

Jetez un œil aux sections décrites ci-dessous sur l'utilisation du microscope.

Préparez un support humide d'eau de bassin (si disponible)

  1. Descendez dans les algues et fumez pour obtenir un très bon échantillon de protozoaires et d'algues si possible.
  2. Concentrez-vous sur l'échantillon en utilisant 10X, puis passez à 40X (NE PAS 100X). Commencez par le fond clair, puis passez au fond noir et au contraste de phase (voir les instructions ci-dessous).
  3. Entraînez-vous avec le microscope, en changeant les réglages des condenseurs, en utilisant différents objectifs. Il n'est PAS important d'identifier les protozoaires ou les algues.

Préparez un frottis et une simple tache du matériau entre vos dents.

  1. Prenez un cure-dent stérile, retirez un peu de matière solide entre vos dents de sagesse et mélangez-le dans une goutte d'eau afin d'avoir une suspension étalée sur le tiers médian de la lame de microscope. PAS DE COUVERTURE UTILISÉE !
  2. Laisse glisser sécher à l'air libre.
  3. Fixation à chaud le frottis sec en faisant passer la lame rapidement à travers la flamme à quelques reprises. Si vos doigts chauffent, vous avez TROP de thermofixation.
  4. Placez la lame sur le fil au-dessus du bac à taches. Inonder le frottis de cristal violet : laisser reposer 1 minute.
  5. Laver BIEN la lame avec de l'eau distillée. Tamponnez la lame de frottis avec votre bloc de papier absorbant.
  6. Concentrez-vous sur l'échantillon à l'aide de l'objectif 10X (Soyez SR que vous êtes en microscopie à fond clair) : vous devriez voir des masses de matière violette, la plupart trop petites pour être vues.
  7. Prêt à passer à 100X maintenant ? Ne pas déplacez la scène ou les boutons de réglage avant de suivez les instructions ci-dessous.
  8. Identifiez les différentes formes et dispositions des bactéries dans votre bouche. La plupart d'entre eux seront en forme de bacille ou de coccus, mais il ne serait pas rare de voir des spirilles. Remarquez les arrangements des bactéries—paires, grappes, chaînes?
  9. Toute lame que vous utilisez pour les frottis est remise dans votre boîte à lames, pour être nettoyée et réutilisée.

Regardez les frottis bactériens préparés

  1. Comme ce sont des frottis colorés achetés, des lamelles sont dessus. Vous utilisez toujours de l'huile sur eux avec la lentille à immersion d'huile.
  2. Assurez-vous d'ENLEVER toute huile avant de les replacer sur les plateaux.

AVANT DE METTRE UNE DIAPOSITIVE SUR LA SCENE DU MICROSCOPE

  1. Trouver toutes les structures sur le microscope (schémas en fin d'exercice) en étant sûr de connaître leurs fonctions. Tournez le condenseur de façon à voir tous les réglages (des lettres blanches sont gravées à l'avant du cadran du condenseur). Déplacez également le diaphragme à iris vers la gauche et la droite pour voir l'effet sur la quantité de lumière.
  2. Élève le étage condenseur TOUT LE CHEMIN. Il y a un bouton spécial pour l'étage du condenseur sous le scène mécanique. Le condenseur recueille toute la lumière disponible de la lampe et la dirige vers la scène. Nous avons toujours l'étage condenseur le plus proche de l'étage mécanique lors de la visualisation des micro-organismes. Lorsque vous regardez des objets plus gros, comme des vers ou des insectes, vous pouvez déplacer le condenseur vers le bas pour améliorer la densité lumineuse frappant le spécimen, mais pas pour les micro-organismes.
  3. Tourne le bouton de réglage de la luminosité jusqu'en haut, puis reculez d'1/4 de tour. C'est là que le bouton de commande restera : ne le touchez plus. La quantité de lumière qui traverse le condenseur est contrôlée par le diaphragme à iris.
  4. Tournez le tourniquet jusqu'à ce que le objectif faible puissance 10X s'enclenche.
  5. Montez la scène jusqu'en haut, en utilisant le réglage grossier bouton. Gardez un œil sur la distance entre la glissière et l'objectif pour VOUS ASSURER que vous n'écrasez pas l'objectif dans la scène.
  6. Nettoyez toutes les lentilles (oculaires, lentilles d'objectif et lentille sur le condenseur) avec PAPIER POUR LENTILLES.
  7. Réglez les lentilles oculaires à la bonne distance pour votre visage (les oculaires peuvent être écartés ou rapprochés selon vos propres besoins). Ces oculaire oculaire les lentilles sont à la fois grossissement 10X.

POUR VOIR UN ÉCHANTILLON

  1. Placez le support humide ou le frottis sur la scène et fixez-le à l'intérieur du clips de scène.
  2. Essayez de deviner où se trouve le spécimen sur la lame et placez-le au centre du trou permettant à la lumière de traverser la scène.
  3. Tout en regardant dans l'oculaire, abaissez le organiser LENTEMENT à l'aide du bouton de réglage grossier. Assurez-vous que vous regardez à travers la tête binoculaire du microscope avec les DEUX yeux.
  4. Dès que vous voyez l'échantillon, ARRÊTEZ d'utiliser le réglage grossier et passez au bouton de réglage fin. Après la mise au point au début avec le bouton de réglage grossier, il n'est plus touché. Toute la mise au point se fera désormais avec le bouton de réglage fin.
  5. CHANGER D'OBJECTIFS:

La plupart des systèmes de lentilles de microscope sont PARFOCALE—les objectifs sont alignés de sorte que la rotation vers un autre objectif puisse être effectuée sans mise au point majeure. Faites pivoter l'objectif 40X en place, en vous assurant qu'il s'enclenche. Votre spécimen devrait toujours être vu dans le champ de vision, mais 4 fois plus grand maintenant. Utilisez votre bouton de réglage fin pour clarifier les objets.

SI VOTRE CHAMP DE VISION EST BROUILLÉ ET QU'AUCUNE QUANTITÉ DE FOCALISATION N'AFFICHE L'OBJET, VOUS AVEZ PROBABLEMENT DES RÉSIDUS D'HUILE SUR L'OBJECTIF 40X. IL DOIT ÊTRE BIEN NETTOYÉ AVEC DU PAPIER POUR LENTILLES.


Faire soi-même des lames de microscope

Il existe trois types de montures parmi lesquelles vous pouvez choisir lors de la réalisation de lames de microscopie. Ce sont le montage sec, le montage humide et le montage préparé. Chaque monture a ses propres avantages et inconvénients. Votre niveau de compétence personnel et l'équipement disponible détermineront la facilité de fabrication de chaque type.

Comment faire des lames de microscope à montage sec

Instructions:

Les montures sèches sont les lames de microscope les plus faciles à réaliser. Vous aurez besoin d'une lame de verre et d'une lamelle. Les supports secs fonctionnent mieux pour les échantillons tels que le pollen, les cheveux, les plumes ou même les particules de poussière capturées dans un filtre à microfilm.

Les étapes de base pour préparer votre propre diapositive à montage à sec sont très simples. Placer l'échantillon sur la lame et couvrir. C'est tout ! Le couvercle fonctionnera pour protéger à la fois votre échantillon et vos objectifs.

Désavantages:

Bien que la fabrication de lames de microscope dans le support sec soit facile, il existe certains inconvénients. Ces supports sont temporaires, sauf si vous scellez la lamelle d'une manière ou d'une autre. Il est également plus difficile de voir les structures plus complexes de certaines espèces. Pour cela, vous devrez apprendre à réaliser une monture préparée.

Comment faire des lames de microscope à montage humide

Instructions:

Faire des lames de microscope dans une monture humide présente de nombreux avantages. La réfraction du liquide permet de voir beaucoup plus facilement les structures complexes. Si le spécimen est vivant, le liquide permettra de visualiser à la fois la couleur naturelle et les motifs de mobilité.

Pour faire un montage humide, placez quelques gouttes du liquide de votre choix sur la lame. Ajoutez le spécimen à votre liquide, puis placez quelques gouttes supplémentaires dessus. Cela garantit que l'échantillon sera recouvert de liquide. Si vous regardez un spécimen aquatique comme des algues, utilisez l'eau dans laquelle réside le spécimen.

Ensuite, appliquez la lamelle. Cela se fait très doucement afin d'éviter la formation de bulles d'air. Abaissez lentement le couvercle en biais, et il finira par être maintenu en place par la tension superficielle. Si la lamelle flotte sur la moitié inférieure de la lame, vous avez utilisé trop de liquide.

Il existe une variété de liquides acceptables pour faire un montage humide, de l'eau du robinet à la glycérine. La chose importante à considérer est votre type de spécimen. Certains spécimens ne font pas bien face à des liquides particuliers. Assurez-vous de choisir votre liquide avec soin pour qu'il corresponde à votre échantillon.

Désavantages:

Les supports humides présentent également des inconvénients. Trouver un spécimen en mouvement peut être un problème. Les lames ont également tendance à sécher à la lumière du microscope. Si vos montures humides sèchent avant que vous ne soyez prêt, appliquez une goutte supplémentaire de liquide sous la lamelle.

Comment faire des lames de microscope à monture préparées

Instructions:

La fabrication de diapositives de montage préparées est plus complexe, même si l'avantage est qu'une fois que vous avez terminé, vous pouvez les conserver longtemps.

Tout d'abord, votre spécimen doit être tranché très finement. Le meilleur outil pour cela est un microtome, un instrument utilisé pour couper des matériaux en tranches poids plume.

Une fois que l'échantillon est suffisamment fin, placez-le sur votre lame. Vous devrez retirer tout excès d'eau. Selon l'échantillon, vous pouvez sécher à l'air, éponger ou utiliser une source de chaleur pour sécher l'échantillon.

Vous voudrez ajouter un colorant comme le bleu de méthylène afin de colorer les structures complexes de l'échantillon. Vous pouvez ajouter une goutte de colorant à l'échantillon, puis placer le couvercle sur le dessus. L'ajout d'un fixateur à l'échantillon avant de mettre la lamelle aide à prévenir la carie.

Le spécimen à droite, un morceau de quadriceps de souris, est coloré à l'hématoxyline. Notez à quel point vous pouvez voir clairement les minuscules structures, qui sont des fibres musculaires individuelles.

Si vous avez un spécimen dans un montage humide, il existe un moyen très simple de le colorer. Placez une goutte de colorant sur le bord de la lamelle. Mettez un petit morceau de serviette en papier sur le bord opposé. Comme la serviette en papier absorbe le liquide, le colorant doit être tiré sous le couvercle et à travers l'échantillon.

La méthode de montage préparée est plus complexe, elle n'est donc pas souvent effectuée par le microscopiste amateur. Ces lames sont destinées à la recherche biologique ou pathologique.

Faire des lames de microscope : Conclusion

N'ayez crainte cependant, si vous souhaitez examiner des structures plus complexes mais que vous n'avez pas le temps/les connaissances nécessaires pour préparer vos propres spécimens, vous pouvez toujours acheter des lames préparées sur Amazon.

Avec un peu de pratique, faire des lames de microscope n'est pas si difficile. Vous pouvez même l'apprécier lorsque vous maîtrisez certaines des techniques. Une fois que vous connaissez les étapes nécessaires, rien ne peut s'opposer à votre propre curiosité !


Lames de microscope : critiques et articles

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Des articles:

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Les montages humides utilisent un milieu de montage liquide, tel que de l'eau, de l'huile d'immersion ou de la glycérine. Les différents liquides ont un indice de réfraction différent et conviennent donc à différents types d'échantillons. Dans la plupart des cas, les montages humides sont des glissières temporaires. Il est cependant possible de pérenniser les lames à l'aide d'un milieu de montage liquide, en maintenant la lamelle en place avec de la colle ou du vernis à ongles. Le choix du milieu de montage liquide dépend de l'échantillon. L'eau est le milieu le plus commun et compatible avec la plupart des spécimens biologiques (après tout, les êtres vivants sont principalement constitués d'eau). La glycérine a des propriétés conservatrices et l'huile est utilisée soit pour des spécimens complètement secs (ailes d'insectes, etc.) soit pour des spécimens hydrophobes.

Les lames de microscope montées à sec n'utilisent pas du tout de milieu de montage. Le verre de couverture est placé directement sur l'échantillon sec, qui est entouré d'air. Ceux-ci peuvent être utiles en cas d'incompatibilité chimique entre l'échantillon et le support de montage. Le pollen et les spores peuvent être observés à l'aide d'un support sec. Les montages à sec produisent cependant une qualité d'image inférieure. Ceci est dû à la forte différence d'indice de réfraction entre l'échantillon et l'air environnant.


L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ? - La biologie

Pourquoi acheter un médium pré-mélangé alors qu'il est bon marché et facile à fabriquer soi-même ?

J.A. Kiernan

Département d'anatomie et de biologie cellulaire

L'Université de Western Ontario

Sommaire. Des instructions sont données pour la fabrication de cinq milieux de montage aqueux : gelée de glycérol, glycérol tamponné avec anti-décoloration, sirop de fructose, gomme-sirop Apathy et un milieu de polyvinylpyrrolidone dont la composition peut être modifiée en fonction des besoins de l'utilisateur. Pour chacun, des conseils sont donnés sur l'utilisation et la conservation des préparations lamelles. Les milieux fabriqués en laboratoire sont moins chers que les supports aqueux commerciaux et ne contiennent aucun ingrédient secret.

À peu près tout ce qui est vendu pour être utilisé dans un laboratoire est scandaleusement cher, et le prix devient encore plus élevé lorsque les choses sont commercialisées dans un but particulier plutôt que pour un usage général. Les supports de montage à base d'eau en sont un exemple. Ils se composent presque entièrement de produits chimiques bon marché tels que la gomme, la gélatine et le sucre, mais une inspection des catalogues récents montre que le support aqueux le moins cher coûte plus d'un dollar par millilitre. Cela revient à 10 cents ou plus pour chaque lame, en plus du coût du verre et des réactifs de coloration utilisés. C'est une question simple de faire votre propre support de montage aqueux, presque sans frais. Les seuls équipements dont vous avez besoin sont quelques petits béchers ou flacons, une source de chaleur et soit beaucoup d'huile de coude, soit un agitateur magnétique. En plus des économies monétaires, il y a une autre bonne raison de mélanger les vôtres : vous savez ce que vous avez. Un support de montage commercial peut être excellent pour ce que vous voulez faire, ou pas. Si la formulation est un secret commercial, il n'y a aucun moyen de le savoir avant d'avoir acheté le produit.

Voici des instructions pour faire quelques milieux de montage aqueux. Ils ne sont pas tous identiques, car il n'y a pas un seul support qui puisse être utilisé pour tous les usages. À l'exception de certains additifs antibactériens, aucun produit chimique dangereux n'est utilisé dans ces mélanges, vous n'aurez donc pas besoin de porter une combinaison spatiale pour les mélanger. Une fois préparés, les milieux de montage aqueux doivent être conservés dans de petits flacons ou flacons à bouchon à vis (10-30 ml) en verre ou en plastique transparent. Le capuchon peut être cimenté en place, mais est généralement amovible en le trempant dans de l'eau tiède. Si le milieu devient trouble ou montre d'autres signes de croissance bactérienne ou fongique, jetez-le et ouvrez une autre bouteille.

Les milieux aqueux sont très utilisés pour la microscopie à fluorescence, et certains de ces mélanges contiennent des substances qui retardent la décoloration des fluorochromes. Certains médias durcissent ou sèchent pour devenir assez solides, d'autres sont toujours liquides. Avec tous, il est conseillé de sceller les bords de la lamelle si vous souhaitez une préparation permanente. Utilisez du vernis à ongles ou un matériau similaire qui ne se mélange pas à l'eau. Tout support de montage résineux, dilué avec un volume égal de toluène ou de xylène, peut être utilisé de la même manière que le vernis à ongles.

Gelée de glycérol.

Ce support de montage traditionnel est le plus difficile à utiliser. Si vous pouvez faire une préparation décente en gelée de glycérol, vous pourrez utiliser n'importe quel autre support aqueux les yeux fermés.

Dissoudre en chauffant et ajouter :

Ajouter Soit une goutte de solution aqueuse saturée de phénol ("phénol liquide") ou 15 mg de merthiolate de sodium comme agent antibactérien. Cela peut être conservé pendant quelques semaines à 4C. Jeter quand il devient trouble ou moisi.

La gelée de glycérol doit être réchauffée à environ 40 °C pour faire fondre le gel avant utilisation. Il doit également être exempt de bulles d'air. Cela peut être fait en chauffant la bouteille (avec le bouchon desserré) dans une chambre d'inclusion sous vide.

Après avoir recouvert de gelée de glycérol, laissez la lame sur une surface plane et chaude (40-45 ° C) pendant environ 30 minutes, pour laisser le milieu s'imprégner dans la section, puis retirez-la dans un endroit frais pour qu'elle durcisse. Il est assez difficile de faire une préparation sans bulles avec ce milieu, et les bulles peuvent être minuscules et nombreuses. Vérifiez avec un microscope pendant que la lame est encore chaude. Si ce n'est pas bon, retirez la lamelle en la faisant tremper dans de l'eau tiède et réessayez.

Ce milieu a un faible indice de réfraction (1,42). Pour cette raison, de nombreuses structures non tachées restent visibles, ce qui peut être un avantage ou un inconvénient, selon ce que vous vous attendez à voir dans la préparation finie.

Glycérol tamponné avec anti-décoloration.

Le glycérol tamponné est principalement utilisé pour les préparations immunohistochimiques fluorescentes. Le pH élevé permet une fluorescence optimalement efficace des marqueurs couramment utilisés. L'ajouté p-phénylènediamine (PPD) (Platt & Michael, 1983) ou m-propyl gallate (Longin et al., 1993 Battaglia et al., 1994), retarde la décoloration.

Soit Tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) : 10 ml

ou Tampon TRIS 0,1 M (pH 9,0) : 10 ml

Soit p -Chlorhydrate de phénylènediamine : 100 mg

ou m -gallate de propyle : 500 mg

Se conserve au moins 3 mois, probablement beaucoup plus longtemps, dans l'obscurité (ce qui protège l'agent anti-décoloration) à -20C. La bouteille de travail est conservée à 4C, pendant une semaine ou deux.

Cela ne se solidifie pas, mais la lamelle peut être maintenue en place en appliquant un peu de vernis à ongles sur ses bords.

Sirop de fructose.

Ce support est suffisamment collant pour maintenir une lamelle en place. C'est le milieu aqueux le plus facile à utiliser, mais trop acide (pH environ 4,5) pour conserver les colorants basiques. Cela pourrait probablement être composé dans un tampon neutre, je n'ai jamais essayé cela moi-même. Le sirop de fructose est utile lorsque vous savez que vous allez retirer la lamelle pour faire autre chose sur la section.

Mettre dans une bouteille bien bouchée et laisser au four (environ 60C) pendant 1-2 jours, jusqu'à ce que tout le sucre se soit dissous pour former un sirop clair.

Se conserve plusieurs mois en rayon à température ambiante.

Avec un long stockage, ce support se dessèche et se cristallise si les bords de la lamelle ne sont pas scellés.

Gomme-sirop d'apathie.

Il s'agit d'un autre support traditionnel : difficile à faire, mais facile à utiliser. Le thymol sert à retarder la croissance des micro-organismes. Un autre désinfectant (voir sous gelée de glycérol) pourrait être utilisé à la place.

Gomme arabique (=gomme d'acacia) : 50 g

Dissoudre les ingrédients en remuant fréquemment et en chauffant de temps en temps au bain-marie. Si de gros grumeaux se forment, la gomme peut mettre plusieurs jours à se dissoudre. Le volume final doit être d'environ 100 ml. Se conserve quelques mois à température ambiante. Jetez s'il s'infecte ou si le sucre cristallise. Sanderson (1994) recommande le fructose (lévulose) au lieu du saccharose, probablement parce qu'il est moins susceptible de cristalliser.

L'indice de réfraction du milieu Apathy (environ 1,5) est supérieur à celui de la gelée de glycérol ou du fructose, et il permet d'obtenir des préparations presque aussi transparentes que celles réalisées avec un milieu de montage résineux.

Milieu polyvinylpyrrolidone (PVP)

C'est mon milieu de montage aqueux préféré. La composition peut être variée selon les besoins individuels (Kiernan, 1990). Pour l'immunofluorescence, compléter dans un tampon et ajouter un agent anti-décoloration.

Polyvinylpyrrolidone (P.M. 10 000) : 25 g

L'eau (ou un phosphate 0,1 M ou

Tampon TRIS, pH 7,4 ou 9) : 25 ml

Dissoudre le PVP en laissant reposer plusieurs heures sur un agitateur magnétique. Puis ajouter:

Les flacons de milieu PVP se conservent généralement 2 à 3 ans à température ambiante. Conservez-le dans un endroit sombre si un agent anti-décoloration a été ajouté. Jeter s'il semble infecté ou devient trop visqueux.

Ce milieu de montage est plus liquide que la gelée de glycérol ou Apathy's. Il est très facile à appliquer et ne fait pas de bulles. L'indice de réfraction est de 1,46 (Pearse, 1968), mais augmente à mesure que l'eau s'évapore sur les bords de la lamelle jusqu'à ce que les structures non colorées soient à peine visibles. Si vous souhaitez un degré élevé de transparence, attendez plusieurs jours avant de sceller les bords de la lamelle.

Battaglia, M., Pozzi, D., Grimaldi, S. et Parasassi, T. 1994. Hoechst 33258 coloration pour détecter la contamination par les mycoplasmes dans les cultures cellulaires : une méthode pour réduire le photoblanchiment par fluorescence. Biotechnologies. Histochem. 69: 152-156.

Kiernan, J.A. 1990. Méthodes histologiques et histochimiques. Théorie et pratique. 2e éd. Oxford : Pergamon Press. [Il existe une 3e édition, 1999 * voir les détails à la fin de ce document.]

Longin, A., Souchier, C., Ffrench, M. et Bryon, P. A. 1993. Comparaison des agents anti-fading utilisés en microscopie à fluorescence : analyse d'images et étude de microscopie confocale laser. J. Histochem. Cytochem. 41: 1833-1840.

Pearse, A.G.E. 1968. Histochimie, théorique et appliquée, 3e éd. Vol. 1. Édimbourg : Churchill-Livingstone.

Platt, J. L. et Michael, A. F. 1983. Retard de la décoloration et augmentation de l'intensité de l'immunofluorescence par p-phénylènediamine. J. Histochem. Cytochem. 31: 840-842.

Sanderson, J.B. 1994. Microtechnique Biologique. (Manuel de la Royal Microscopical Society n° 28) Oxford : BIOS Scientific Publishers.

Valnes, K. et Brantzaeg, P. 1985. Retard de la décoloration de l'immunofluorescence au cours de la microscopie. J. Histochem. Cytochem. 33: 755-761.

* Kiernan, J.A. 1999. Méthodes histologiques et histochimiques : théorie et pratique. 3e éd. Oxford : Butterworth-Heinemann, p. 52. Réimprimé en 2000, et maintenant publié par Arnold Publishers, Londres - (ISBN 0750649364) Disponibilité en Grande-Bretagne Disponibilité aux États-Unis Disponibilité au Canada

Copyright (c) 1997 par Today Enterprises.

Article publié dans La microscopie aujourd'hui 97-10 p. 16-17 (1997).


Préparation du KOH à montage humide direct :

La préparation directe d'échantillons de selles sur support humide est largement utilisée pour l'analyse parasitologique en laboratoire et également pour le diagnostic des parasites intestinaux par la méthode microscopique. KOH – Hydroxyde de Potassium, est largement utilisé dans la préparation directe de montage humide pour différents échantillons, par exemple des éléments fongiques et des champignons, des cheveux, des écailles de la peau et le grattage des ongles ou d'autres échantillons cliniques avec de petites gouttes d'hydroxyde de potassium à 10 % – KOH sur un verre faire glisser. L'hydroxyde de potassium digère les débris cellulaires persistants/résolus et blanchit les pigments, détache leurs constituants sclérosés mais n'endommage pas leurs constituants cliniques. Ils donnent donc une excellente vue à l'examen microscopique.


L'huile peut-elle être utilisée à la place de l'eau dans la préparation des supports humides pour la microscopie ? - La biologie

Image de l'aile volante - C'est une mosaïque de quatre images différentes. Une photo prise avec l'objectif x40 de la zone encerclée
serait utilisé comme test de comportement pour les différents supports de montage décrits ci-dessous.

PARTIE 1 PARTIE 2 PARTIE 3

INTRODUCTION

Dans un laboratoire d'histologie de recherche, ou un laboratoire de pathologie, le montage est la dernière procédure de la série qui se termine par une préparation histologique permanente sur table, bien après 1) la fixation, 2) l'inclusion en paraffine, 3) le sectionnement, 4) la coloration, 5 ) des opérations de déshydratation et 6) de nettoyage.

Hormis quelques exceptions, les amateurs s'engagent rarement dans des recherches nécessitant des techniques histologiques longues et compliquées. La plupart de leur travail est fait sur du matériel vivant. Bien que parfois, beaucoup d'entre eux peuvent avoir besoin ou vouloir conserver certains matériaux pour une étude future, ou pour faire une collection comparative d'échantillons, ou pour voir des détails cytologiques tels qu'un noyau cellulaire.

Après quelques traitements préliminaires, ils aimeraient monter les objets ou organismes en tant que préparations semi-permanentes ou même permanentes.

Normalement, ils manipulent des organismes entiers ou des parties disséquées d'eux et souvent les microscopistes montent leurs créatures sans coloration. Certains sujets peuvent même être montés sans aucune manipulation préalable, surtout s'il s'agit d'objets secs. Dans cette série sur les techniques microscopiques, cela rend l'étude des supports de montage plus facile et utile, en inversant ce qui serait le calendrier de présentation habituel.

Baume du Canada.- Le support standard pour l'histologie, mais aussi pour la taxonomie, qu'elle soit zoologique ou botanique, est le baume du Canada, une résine naturelle désormais rare et très chère. Ceci est préparé en recueillant la résine exsudée par Abies balsamique (le « sapin baumier ») et en le diluant dans des solvants (dont beaucoup sont maintenant considérés comme toxiques, par exemple le xylène).

D'expérience à ce jour, les préparations montées Canada Balsam durent plus d'un siècle.

Comme Canada Balsam ne se mélange pas à l'eau, le montage dedans implique l'utilisation d'une séquence de déshydratation, en commençant par des alcools de faible qualité, suivis par des alcools de haute qualité, de l'alcool absolu, des agents de clarification mélangés plus de l'alcool, des agents de clarification, des agents de clarification mélangés avec du xylène , du xylène pur et du baume dissous dans du xylène , du toluène ou du benzène pourraient être utilisés à la place du xylène .

Mais les trois solvants sont également toxiques et dangereux. (Le texte en rouge implique des substances toxiques.) Le développement de certains supports synthétiques comme substituts du baume ne résout pas le problème, ce sont des marques déposées, tout aussi chères, qui nécessitent les mêmes étapes, et utilisent les mêmes solvants (toxiques). Il existe des substituts propriétaires moins toxiques et moins dangereux, mais ils sont chers.

Alternatives.- Les amateurs souhaitent normalement un moyen plus simple de faire monter leurs créatures et n'ont normalement pas besoin d'un support de montage « à l'épreuve des 100 ans ». Ils ont besoin de supports faciles à trouver, faciles à utiliser, non toxiques, peu coûteux et raisonnablement durables (peut-être des mois, peut-être quelques années) qui assurent une vision claire avec un bon contraste des traits morphologiques qu'il (ou elle) recherche.

Il existe plusieurs de ces supports de montage. Certains d'entre eux sont résineux, plusieurs sont aqueux. Mais normalement, un seul est abondamment cité dans la bibliographie d'un amateur. C'est de la gelée de glycérine, une option très utile, mais pas la seule ni la plus facile à utiliser. Je passerai en revue ces médias, en sélectionnant uniquement les non toxiques et en fournissant des formules et des notes pour leur application. Mes formules dans de nombreux cas ne sont pas l'original, ni même les formules classiques. J'ai eu recours à des ingrédients faciles à trouver, dont beaucoup à usage domestique, élevés ici au rang de laboratoire.

Indice de réfraction.- Chaque fois que je connais la valeur, je donne le Indice de réfraction (IR) de la monture proposée. L'indice de réfraction est important car il régit le contraste entre le détail que vous recherchez et l'arrière-plan, ainsi que la transparence de l'échantillon observé par rapport au fond clair du microscope. Un média avec un indice plus élevé donne plus de transparence. Le support de montage doit toujours avoir un RI supérieur à l'échantillon monté. Some aqueous media have an index of about 1.41 (very pure water has an index of 1.33) but Canada Balsam has an RI of 1.524, very near that of the glass of slides and coverslips. Naphrax which is used as a specific mountant for diatoms, whose frustules are made of a material similar to glass, has a very high RI of more than 1.65 . There is now even a synthetic media that reaches a really high 1.70+ RI.

Natural media or synthetic ones of RI = 1.5 or more are used routinely in histological mounts of tissues, previously stained and cleared. Most objects (including micro-crustacea, or arthropods) look good when recently mounted in them, but show additional undesirable clearing as time passes by, and many important details, such as setae in cladocera, or copepods or acarii, could become invisible. For these materials the modest RI of the friendly aqueous media are actually a better choice.

Selected mounting media.- We shall review pure water, glycerin, sugars (karo and fructose), gum arabic, gelatin , and PVA . I disregard Damar , a very economic alternative to balsam, generally used as a xylene solution, because it is not soluble in any easy to obtain, or safe, solvent. Together the selected products provide a selection of aqueous media, two of them liquids (antiseptic water and glycerol) the others solids, and also one easy to use synthetic resinous medium, NPM (Nail Polish Mountant) that I proposed in a previous article in Micscape Magazine (see references).

Standard subject - To review the practical solidifying mountants and to provide some comparative images to judge its behavior, it's best to start with an easy to mount standard subject. And to use a dry one, that needs no fixative, nor any stain to be applied before mounting. I selected fly wings as my, more or less easy to find, standard objects. Of course for some special mountant media I needed and added some alternative test objects.

Equipment.- Most of the cited equipment is obvious. But throughout the article I speak about capsules . In professional papers the descriptions would be most probably watch glasses , Syracuse glasses or cavity blocks . These are useful pieces of equipment. If you have them, or could buy them. don t hesitate, they are the best choice.

But if you don t have watch glasses make a visit to your old relatives. They surely have consumed some medicine tablets sealed in those dimpled plastic sheets. If they take care to not push up the tablet, thereby ruining your prospective laboratory equipment, they can provide you with an assortment of sizes of concave plastic recesses (capsules) which are very useful for your laboratory work. Select the largest for the actual purpose. I have concave circular capsules of 10, 12, 15 and 17 mm in diameter, and also some useful ones of 8 x 22 mm.

Here in Durango I have identified one almost ideal large plastic capsule: the caps of one brand of ice-cream cones are plastic cupules of 5.5 cm in diameter. I must make a big sacrifice to acquire one dozen of them, but you understand that science is a priority for me.

Of course don t use them with powerful solvents such as xylene, or acetone. If your materials allows you the use of a white opaque background (indeed it is an advantage in the process of staining) you have recourse to the plates with several concavities, or to the little individual dishes that watercolour artists use to mix their colors.

In addition you may need droppers, tweezers or forceps, fine pointed brushes, wire loops, mounted needles, fine pointed scissors, and a small scalpel. I've searched for but haven t found a substitute for test tubes. There are very useful. If you can, you must buy a dozen or so of 1 cm of internal diameter and a length of no more of 8 to 9 cm. Richard Howey has made a sound review of the laboratory materials an amateur can use more often. Please read his articles . (See the references.)


NOTES AND FORMULARY LIQUID MEDIA

AW.- ANTISEPTIC WATER
(Defined here as water containing some diluted fixative, i.e. the water containing the fixed sample.)

This technique has much to do with the usual method of temporary water mounts (wet mounts) you use when studying water samples, microscopic algae and organisms you have just collected in your favorite pond. Except you don t use pond water and live organisms. This is not of course a long lasting mounting medium, but it is useful when you don't want to have your critters drying out, after a long session of microscopic work.


A collection of vegetable debris with Paramécie and what is probably a Tetrahymena. Paramécie alive. x40. Rheinberg oblique illumination.

Many times we return from our field trip with some different samples with one characteristic in common: they are a collection of concentrated planktonic microorganisms, or a handful of detritus, some times very fine, from many possible origins, with probably thousands of interesting .but hidden organisms.

Suppose you have a plankton sample. You mount your drop between slide and coverslip, and start your search. You find many interesting subjects that you want to measure, or to draw or photograph. In a few your sample may be crushed, or lost. You must continuously add water with a fine pointed pipette to the coverslip border or, better yet, you can seal the water medium to stop evaporation.

Do not absorb the excess water with absorbent paper, this can remove just the critter you are most interested in. Let the preparation evaporate just to the point in which there is no more water outside the coverslip. Now with a fine brush, or the tool I describe afterwards, put one little drop of sealant in each of the four corners. Give the sealant opportunity to set, and continue sealing all the borders.

If you have not fixed your critters, with time they will asphyxiate and disintegrate. It would be a good precaution to take two samples. You take home one of them alive and treat it with all the precautions Richard Howey has explained in his recent Micscape article.

You can fix the other using one of the recommended traditional formulae, that, before the new trend for safety were mostly composed of formalin, glutaraldehyde, mercury chloride and other chemicals . They are now reported to be toxic, and not recommended for amateurs.

One useful, effective and safe fixative, that I have designed to fix protozoa, rotifers and the like, has a mild action, and which even preserves the green color of algal plastids for a while, is:

GALA 20 GALA 60 60 (professional formula)


GALA 20 is less prone to distort delicate organisms such as protozoa. For most of the other microinvertebrate groups use GALA 60.

Preparing the formula.- Don t be deceived by the low concentration of the active substances in the formula. Ça marche. Put 100 ml of water in a suitable flask. Mark the level accurately. Empty the flask. With a 20 ml hypodermic syringe withdraw 1 ml of lactic acid, 5 ml of glycerol, 10 ml of vinegar (that is: 9.5 ml of water and 0.5 ml of acetic acid), and some water. Agitate to mix. Put the mixture in the flask. Syringe out some water, agitate to wash the remnants of the lacto-acetic mixture. Pour into the flask. Repeat one or two additional times. Add the alcohol (21 ml at 96% = 20.2 ml absolute alcohol and 0.8 ml water more or less). Now replenish the flask with water to the 100 ml mark, and stir until the solution is homogeneous. Alternatively, if you are in the rich group of amateur microscopists, use your measuring pipettes and graduated cylinders, to prepare your formula.

Label your flask as GALA 20 fixative (because it is composed of G lycerol, A lcohol 20%, L actic acid and A cetic acid) or GALA 60 if you have used the higher alcoholic formula.

Fixing the sample.- To fix your plankton sample (or any aqueous sample with suspended organisms of the same order of sizes) you must add to it 1/10th of its volume, of this solution. (1 drop to 9 drops, or 1 ml to 9 ml, etc) and agitate well to mix immediately. If you want to fix larger animals (some micro-arthropods, hydracarina, some anesthetized worms, arthropod larvae etc.) put them directly in the concentrated fixative (2, 3 or more volumes of fixative by 1 volume of biomass).


Paramécie fixed and mounted in GALA 60. As I did not used any clearing agent it is somewhat opaque. Nevertheless the exploded trichocysts and the macronucleus are visible. Monostyla lunaris.- a rotifer fixed and mounted in GALA 60

Searching your sample.- Of course you can search your materials as is , or apply some color to better differentiate them from the detritus, or to identify some organelles. One beautiful and useful dye is Rose Bengal , but as for all the good reagents of old times it is forbidden now. It is toxic. In future articles on staining I hope to review some safe (but inferior) substitutes.

To make your preparation, to aid with the evaporation problem, and to give the subjects a minimal clearing that mimics the live appearance of many micro-invertebrates, mix one drop of fixed sample with a drop of glycerin, or even lactoglycerol (see formula below). Allow to stand for one minute, cover and start your observations. If the materials promise a long working session proceed to seal. You can search by this technique thecamebae, gastrotrichs, rotatoria, nematodes, microalgae and the like. Some specimens, especially some of the protozoa, microoligochaeta and other soft bodied organisms don t support this drastic procedure and become dehydrated and wrinkled. With these materials you'd better proceed to mount in glycerol or lactoglycerol (see formula below) with all the precautions I explain later.

Sealant media.- For sealants you can use solid vaseline, paraffin wax or beeswax, Valap (see below), or nail polish. Your choice depends on how long you intend to store your preparation. The selection order is also the order of duration of the different media. A liquid preparation sealed well with nail polish could last some months. The other media need to be applied melted, they remain more or less soft, and can be easily ruined, except Valap, that adheres well to glass, but is also easy to remove if you want to recover your slide, and actually is the other media to be recommended. This is its formula:

Paraffin 1 part in weight
Vaseline 1 part in weight
Lanolin 1 part in weight

Mix, melt at a low heat and pour in a shallow profile can and cover. Allow to solidify and melt the quantity you need with the following sealing tool.

One sealing tool: you can melt the solid sealing media and use a small fine pointed brush to apply it, but it is very difficult to apply a neat coat to all four sides of your coverslip. An old economic sealing tool can be of help here.

Take a metallic wire, 2.5 mm in diameter, bend the tip at a right angle, to make the bent portion the same length as the side of the cover slip you use most often, and if you wish, make a loop at the other end as an aid to manipulate the tool.

Now, with a spirit lamp, or a cigarette lighter, apply some heat to the sealing wire. Touch the surface of the solid sealing medium. It melts. With the tip of your tool, touch every angle to fix the cover with a little drop of medium. Now apply the heated side of the wire to the medium and to each border. The molten medium spreads evenly along the sides and you have a very good seal all around. It takes only a few trials to become an expert. Use this tool with Vaseline, the waxes and Valap.

Comments: These simple, temporary mounting methods, are probably the ones which you would use most often, hopefully with much success. They are useful with hydracarina, thecamebae, nematoda, loricate rotifers, most of the Gastrotricha, Chlorophycea (which retains its green color for a long while), euglenoidina (many of them showing his flagellae), desmids and Cyanophycea.

A desmid retaining the color of its chloroplasts after two weeks fixed and mounted in GALA 60.

The entomostracans (cladocera and copepods) have calcium in their exoskeleton that could be dissolved by this highly acidic fixative. So you better fix and preserve them with 70% alcohol. If you fixed them with GALA, because they were mixed with other critters, select them after a few hours, and store in 70% alcohol.

Ciliates can be well preserved, showing their nucleii (macronucleii at least), and cilia. Those that have trichocysts, as Paramécie do, show them exploded most of the time.

Only for comparatively long lasting collections, morphological detailed studies, and demonstration purposes, or when your materials need clearing, as in many arthropods for example, you must resort to the more dense, permanent and more difficult to use mounting media.


Left picture: Probably a Tétrahymène. Right picture: A couple of conjugating Paramécie. Both fixed and mounted in GALA 60. The pictures increase the general opacity and the contrast of the nuclei. They are less contrasty, but easily visible in the mounted materials, without using dyes or clearing agents.

A note on mounting samples in aqueous media: Quite frequently, water evaporation applies a high pressure to the subjects with the risk of delicate subjects being crushed. To avoid this you must resort to the inclusion of some supports for the coverslip. Those supports must be thin enough to permit a high resolution objective to be used, but thick enough to give room for the observed subjects.

Use at will pieces of thin coverslip, paper, plastics, hairs or textile fibers. Many thin adhesive tapes can be cut into thin strips and neatly adhered beforehand to the slide.

Think before you have resort to these methods, because you can t revert the situation. If you think that it is possible that you may change your mind and want to slightly squeeze an organism, it is best that you use, instead of any of the fixed height materials, tiny balls of very soft wax, or drops of solid vaseline. These allow you to put a more or less controlled pressure on the coverslip, to stop the displacement of an organism or to reveal more clearly its internal organization.

Labeling.- Even with these not so permanent preparations you must label your slides. At least write the name of the mounted subjects, the source of the materials, any treatment applied, the mounting media, and the date . Add your name if you want.

Even if the slides are to last for only some weeks or a couple of months, when you make a revision you may have forgotten those details, and be sorry you did not label them. You can make the labels on your computer. But you must write the information with a good indelible black drawing ink or perhaps you could finish with an illegible label caused by accidentally wetting it.

MOUNTING IN PURE LIQUID GLYCEROL

PG.- PURE GLYCEROL

Glycerol, also known as glycerin, is a common product, cheap, and easily acquired in any drugstore. It's a very hygroscopic alcohol, with a weak syrupy consistency and when anhydrous has an RI = 1.46 . Buy well sealed small bottles of glycerol and open it only for the time needed to take out the drops you use.

It is most probable that glycerol was used, as a temporary mounting medium, from the very beginning of microscopic techniques. It is most easy to use. Put a drop of glycerol on a slide. Include the test object (our fly wing), removing it from water, or alcohol, cover and go to the microscope.

Many microscopists seduced by this simplicity, the very high compatibility of glycerol with many solvents, and the added fact that it is a mild clearing agent, that imparts a fair transparency to the small biological materials it impregnated, tried to make it the mounting media for their permanent preparations.

The straightforward method is to seal the glycerol mount. It is not at all easy, but it is possible.

When you want to turn your glycerin mounted slide into a more or less permanent preparation, put the slide on the table over one or two sheets of paper. Cover it with one sheet of absorbent paper (thick kitchen towels work, or even toilet paper) and slide the edge of your hand from end to end of the preparation, taking care not to exercise an excessive pressure. This squeezes the excess of glycerol from under the coverslip into the towel.


Stoma on the epidermis of the underside of a leaf of Tradescantia virginica. Fixed in AFA (alcohol, formalin, acetic acid). Mounted in glycerin. No stains applied. The well known epidermis of an onion. Fixed in AFA. The staining method will be explained in a future article. Mounted in glycerin.

Uncover the slide very carefully, wrap your finger in some thin non-absorbent plastic sheet, support one side of the coverslip, and with extreme care wipe with a dry cloth all the oily remnants you can. Now you need to seal the coverslip.

First of all put one drop of nail polish on each of the four corners, and allow to dry completely (not less than half an hour). Now support your coverslip, moisten a cloth with a little alcohol and wipe very carefully all the contours of the coverslip. Any rough movement and you'll ruin all your work. Use a dry cloth to finish. Both the slide and cover slip must be dry, with no glycerol present at all.

Now seal all four sides with a nail polish layer that overlaps more or less 1.5 mm of the cover, and on the slide. Or use your sealing tool and Valap. Particularly take care to also cover the four corners you fixed earlier. Laisser sécher complètement. Wipe with alcohol, and apply another, very carefully applied, sealant layer of NP. Normally Valap won t need a second layer.

Make a check next day. Glycerol is highly hygroscopic and absorbs water greedily. If there is a minimal opening in your sealant there'll be a glycerol-water mixture flowing out. Dry, wash with alcohol, seal the opening. Make a daily check for one or two weeks. When you are satisfied there are no more leaks, finish the seal with automotive or hobby paints.

As the mounting media is a fluid, you must file these preparations in flat horizontal trays, otherwise the subjects can be displaced. Carefully label them of course.

As to the permanency of these glycerol preparations, it's worth pointing out that J.G. Baer, a French helminthologist, reviewed in 1931 the taxonomic characters of Temnocephala mexicana, Vayssiere, 1899 from the type slide mounted in glycerol, and filed in the collections of the Museum d Histoire Naturelle, at Paris, France for 31 years. (T. mexicana is a platyhelminth that lives on some crabs.)


This is the first picture of the test object. Fly wing collected and preserved in alcohol 70%, and mounted in glycerin. Head of the larvae of a Sarcophage fly. Fixed in 70% alcohol, it was gradually passed through increasing concentrations of glycerin and mounted in 100% glycerin.

Difficult materials.- As I said, glycerol is hygroscopic. It acquires water from all substances that contain free water. When a soft biological object is surrounded with glycerol, water will pass from the object to the glycerol, and is replaced by it. The problem is that glycerol diffuses to the biological materials at a slower rate than when water goes out. The results of this imbalance is the biological materials are shrunk and distorted. To make a useful mount of this kind of subjects we must resort to two useful tricks.

1) In a series of capsules put a series of increasing concentrations of glycerin, starting with the 10% side of the scale (20, 50, 75 could be the other steps). Put your materials in the first one and leave enough time. (Of course you must guess, and try some times, until you found the correct one for your actual material. Twenty or thirty minutes are wise initial guesses.) Using a suitable spatula or a little brush or a wire loop, or even an eyedropper, transfer the materials with care from one capsule to the next, leaving them for the same time in any one. Perhaps after more or less two hours you are done. Transfer the subject in the drop onto the slide, as was explained before.

2) Often the first alternative is good enough. but Seinhorst (1959) working with difficult nematodes, designed a technique to gradually replace the fluids with glycerol without disrupting the organ structure of the worms. By the same nature the method is excellent for any delicate material.

The materials, first collected in water, were then transferred to a capsule with a 1% solution of glycerol in 20% alcohol (more or less).

alcohol 96 21 ml
water 78 ml
glycerol. . 1 ml

Now take a wide mouthed flask, with a screw cap, not very tall. One of those short and wide containers that hold creams for the skin or hair fixatives, are good. Put in the bottom a cap from another smaller diameter flask, as a platform to support the capsule. Pour in 96% ethanol almost to the height of the platform, and put the capsule with your materials on the platform. Spread some solid vaseline on the rim of the flask. Screw on the cap of the interchange chamber tightly and set aside for 12 to 24 hours in a warm place. It s better if you apply some heat, say 35-40 C. In the interim all water in the capsule was to be replaced by alcohol.

Now fill the capsule with a solution of 5% glycerol in 96% ethanol, and put it in a partly closed container. In 3 or 4 hours at 40 almost all ethanol has evaporated, and your subjects must be in almost pure glycerol. Normally you can now proceed to mount in pure glycerol.

3) One special case is the mounting of mixed microscopic microinvertebrates, which because of their minute size cannot be manipulated individually, or in sorted uniform groups, and must be mounted in some liquid media. (The samples we spoke about in the antiseptic water section). The following, although not easy to apply, is a useful protocol.

une. Fix and preserve the materials in a suitable fixative (GALA is a good
alternative). Allow at least 6 hours for a good fixation.
b. Have a look at the sample to see if they are the critters you are searching for.
If there is a need for some staining (await a future article) this is the moment to
apply it.
c. Take a sample (say 19 drops). Add 1 drops of glycerin mixing very well after
the addition. You now have a solution with 5% glycerin. Set aside for 15 minutes.
ré. Add a new drop of glycerin, mixing well.The concentration is now near 10%.
e. With a syringe and a fine hypodermic needle remove half of the supernatant
liquid. If you work with care you now have 10 drops with more or less 9 drops of
sample water and 1 drop of glycerin. (10% glyc.) Add 2 drops of glycerin and mix well
. This amounts to 12 drops (9 + 3) of 33% glycerin (more or less). Set aside for 15 min.
e. As the density of the liquid increases, so the sedimentation time is longer.
Give enough time to have almost all of your sample in the test tube or concave
capsule bottom.
F. Now take one clean slide and put one drop of the concentrated sediment in the
centre. Mix well with another drop of pure glycerin or lactoglycerol (see below), and
couverture. You must make a fair estimate of the volumes to have a very thin
preparation but full to the margins of the cover.
g. Seal if you wish. The method is not quick, nor easy, but gives you pretty good
preparations of many difficult to preserve microinvertebrates

REMARQUES: Make your preparations as thin as you can. Resolution is impaired in thick liquid preparations, and also it affects the quality of the sealing. Always allow enough time for the sealant to set completely. Never use the 100x OI objective (if you have one), with unsealed preparations.

LG.- LACTOGLYCEROL

I should point out that glycerol has a mild clearing power, enhancing the transparency of fixed cytoplasms and other small opaque subjects. The combination of glycerol with lactic acid (a more powerful clearing agent) produces a medium that is very useful to allow a better observation of opaque materials and organisms, like worms, plant materials and specially small arthropods.

Lactoglycerol is normally a 50/50 mixture of both reagents, but you can freely use other percentages according to the clearing action required by your subjects. It is most often used as a temporary mountant, but with suitable precautions, a satisfactory preparation can be turned into a permanent one. The manipulations are much the same as with just glycerol, but sealing is more difficult.

Lactoglycerol is more dense and syrupy and is more difficult to clean the outside of the coverslip. You must anchor the four corners, waiting until the sealant is very well set. With an absorbent paper wipe all the excess liquid you can. With a soft absorbent tissue wetted with ethyl or methyl alcohol or even acetone clean the slide with care. Always try to have the thinnest preparation that you can. When you are satisfied of the cleanliness you have attained, seal with Valap. Inspect after a few days to be sure you have no break in the seal. Cover Valap with a layer of nail polish and finish with another of an automotive paint. Label your slide.

Pantin's solvents density gradient.- If you like to mount a micro-arthropod (a mosquito larva as an example) you must clear the organism if you want to see the details of its structure. One of the methods is to dissolve the soft parts (all the internal organs) with hypochlorite or potassium hydroxide. Both are potentially harmful.

A safer method, usually enough for our purposes is to use the lactoglycerol mixture as a clearing agent. If you submerse the subject directly in lactoglycerol you know the result: a wrinkled and awful organism, mostly unusable. You can resort to gradual changes of higher concentrations of lactoglycerol.

But Pantin at the end of the 1930 s proposed a very useful and elegant method that provides organisms beautifully cleared with only one (long) easy step.

Take a test tube or similar, put 2 or 3 ml of lactoglycerol at the bottom. With all your care, with a long pipette, glide 2 or 3 ml of glycerol over the first layer. You can disturb it a little but only at the very interface to start a process of mixing. Now in the same way, make an upper layer of 96% ethanol.

With your tweezers, or a glass bar, or an entomological mounted needle, pick the subject from the alcohol in which you have it stored, and drop it on the alcohol upper layer. The organism drops to the interface of alcohol-glycerol and stays floating there for a long while.

If it is your first time you'll certainly want to watch the process, but better you go to take a nap or make other observations you were planning.

The larvae or other organism you leave bathing in the alcohol slowly mixes with the layer of glycerol, interchanging the alcohol, and after a time it sinks to the interface of glycerol and lactoglycerol where it repeats the process.

At the end you could recover the organism from the bottom of your tube. Perfectly cleared and with much less distortion . and requiring less effort from you.

Experiment, and become addicted to the method.

The organism you have cleared can be mounted in lactoglycerol or in some of the more solid mountants I describe in the next article.


These four pictures show the clearing power of lactoglycerol. The mosquito larva was fixed in 70% alcohol, and cleared using the solvent density gradient of Pantin. The solution layers used were alcohol 70% - glycerin - lactoglycerol. The sunken larva was mounted in pure lactoglycerol. The third picture shows the nucleus of the cells inside the caudal paddles. The fourth one shows two muscular cells at the end of the body. The left one shows the nucleus. The right one shows that these are striated muscle cells. Focus was a compromise to show both details in one picture
Click the first photo to see a fully labeled picture.

Another method for using glycerol as a mountant.- As you see above the biggest problems with glycerol and lactoglycerol arose from their nature as being viscous and hygroscopic liquids. Microscopists solve this by converting glycerol to a solid. The commonest solid form is glycerin Jelly. I have two other useful formulae fructogel and glycogel.

All of them are explained in the third part of this series. In the next (second part), I will explore the use of gums and sugars alone or in several combinations.

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Published in December 2002 Micscape Magazine.

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