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15.2 : Purification des Protéines (Activité) - Biologie

15.2 : Purification des Protéines (Activité) - Biologie



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Exclusion de taille des molécules de colorant

À titre de démonstration, l'instructeur peut illustrer le concept d'exclusion de taille sur un ensemble de colorants alimentaires mélangés.

Chromatographie d'exclusion stérique des colorants alimentaires.

  1. Laissez la colonne se vider au-dessus d'un bécher.
  2. Chargez soigneusement 0,2 ml de mélange de colorant alimentaire sur la colonne.
  3. Placer 10 tubes sur un rack sous la colonne.
  4. Placer un tampon de 1 ml sur la colonne et recueillir des fractions de 0,5 ml.
  5. Continuez à ajouter du tampon 1 ml à la fois jusqu'à ce que toutes les fractions aient été collectées.

Taille-Exclusion des Protéines

Cet exercice vise à purifier la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente bleue (BFP) du lysat bactérien. Ces protéines ont une taille spécifique de 238 acides aminés et sont de 40 000 daltons (40 kD). En fonction de leur taille spécifique, ils auront un taux de migration spécifique à travers la résine d'exclusion de taille. N'oubliez pas que le lysat bactérien est plein de protéines supplémentaires qui ne sont pas votre protéine d'intérêt que nous essayons d'isoler.

modèle 3D de GFP (En haut à gauche), BFP (En haut à droite), alignement structurel de GFP et BFP (Centre) et l'alignement de séquence (En bas) illustrant les 3 changements d'acides aminés pour produire la protéine alternative. Les astérisques rouges indiquent l'emplacement des mutations.

Les gouttes de liquide seront recueillies par fractions. Les fractions contenant les protéines fluorescentes ne se retrouveront que dans des fractions spécifiques qui seront visibles sous illumination UV.

  1. Montez verticalement la colonne sur un support annulaire. Assurez-vous qu'il est droit.
  2. Faites glisser le capuchon sur le bec au bas de la colonne.
  3. Bien mélanger la suspension (tamis moléculaire) en la remuant ou en la remuant doucement.
  4. Pipeter soigneusement 2 ml de la suspension mélangée dans la colonne en la laissant couler le long des parois intérieures de la colonne.
  5. Placer un bécher vide sous la colonne pour récupérer le tampon de lavage.
  6. Retirez le capuchon du bas de la colonne et laissez la matrice se tasser dans la colonne.
  7. Étiquetez huit tubes de microcentrifugation #1-8.
  8. Chargez lentement la colonne avec 0,2 ml d'extrait de GFP. Laissez l'extrait entrer complètement dans la colonne.
  9. Ajouter 1 ml de tampon d'élution sur la résine sans perturber la résine.
  • Ajouter du tampon lentement (plusieurs gouttes à la fois) pour éviter de diluer l'échantillon de protéines.
  • En utilisant les marques graduées sur les côtés des tubes, prélevez des fractions de 0,5 ml dans les microtubes étiquetés.
  • Continuer à ajouter 1 ml de tampon et collecter des fractions jusqu'à ce que tous les tubes soient pleins.
  1. Vérifiez toutes les fractions en utilisant les UV à ondes longues. lumière pour identifier les tubes qui contiennent les protéines fluorescentes GFP ou BFP.
  2. Une purification supplémentaire peut être effectuée avec une résine différente avec les quelques fractions contenant la protéine d'intérêt.
  3. Les échantillons de protéines doivent être analysés sur un gel d'acrylamide et colorés contre toutes les protéines pour vérifier la pureté de l'échantillon ou les mesures de fluorescence prises.

Isolement, purification, clonage de gènes et expression de protéine antifongique à partir de Bacillus amyloliquefaciens MG-3

La protéine antifongique a été isolée et purifiée à partir de B. amyloliquefaciens MG-3.

La protéine antifongique est une sérine protéase d'un poids moléculaire de

La protéine antifongique a montré de bonnes stabilités à la température, au pH et à la protéase K.

Les protéines antifongiques ont inhibé la croissance des champignons pathogènes et la pourriture des fruits chez les nèfles.

La protéine antifongique recombinante a supprimé efficacement la croissance de C. acutatum.


Système CP5, pour une purification des protéines simple et très efficace avec une mini-étiquette conçue pour le C-terminal

Il existe de nombreuses stratégies pour purifier les protéines recombinantes d'intérêt, et la purification par affinité utilisant un anticorps monoclonal qui cible une séquence épitopique linéaire est l'une des techniques essentielles utilisées dans la biochimie et la biologie structurale actuelles. Nous présentons ici un nouveau système de purification de protéines utilisant une étiquette CP5 très courte. Tout d'abord, nous avons sélectionné le clone d'anticorps monoclonal de lapin Ra62 (anticorps Ra62) du récepteur anti-dopamine D1 (DRD1) comme anticorps de capture, et identifié sa séquence d'épitopes minimale comme une séquence d'acides aminés 5 à l'extrémité C-terminale de DRD1 (GQHPT-COOH, séquence D1CE). Nous avons constaté que la substitution d'un seul acide aminé dans la séquence D1CE (GQHVT-COOH) augmentait le taux de dissociation jusqu'à 10 fois, et avons nommé la séquence d'épitope conçue balise CP5. En utilisant l'anticorps Ra62 et 2 peptides d'affinité différente, nous avons développé une nouvelle méthode de purification des protéines d'affinité, le système CP5. L'anticorps Ra62 capture rapidement la protéine cible marquée par CP5, et la protéine marquée par CP5 capturée a été éluée en entrant en compétition avec le peptide D1CE d'affinité plus élevée. En prenant la différence d'affinité entre D1CE et CP5, une élution nette dans des conditions douces a été obtenue. En utilisant le système CP5, nous avons purifié avec succès la deubiquitinase CYLD et l'ubiquitine ligase E3 MARCH3 et détecté leur activité catalytique. En ce qui concerne les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), 9 des 12 récepteurs acellulaires synthétisés ont été purifiés, démontrant leur capacité de purification des protéines membranaires intégrales. Le CHRM2 marqué par CP5 exprimé par la cellule baculovirus-insecte a également été purifié avec succès par le système CP5. Le système CP5 offre plusieurs avantages distincts en plus de sa spécificité et de ses performances d'élution. L'étiquette CP5 est facile à construire et à manipuler en raison de sa courte longueur, qui a moins d'effet sur les caractères protéiques. L'élution douce du système CP5 est particulièrement adaptée à la préparation de protéines délicates telles que les enzymes et les protéines membranaires. Nos données démontrent que le système CP5 offre une nouvelle option prometteuse dans la préparation d'échantillons de protéines avec un rendement, une pureté et une activité élevés pour les applications en aval dans l'analyse fonctionnelle et structurelle.

Déclaration de conflit d'intérêts

Intérêts concurrents : Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun intérêt concurrent.


2. Matériels et méthodes

2.1. Intestin grêle de chameau

L'intestin grêle de chameau a été obtenu de l'abattoir du Caire. L'intestin grêle a été conservé directement dans une glacière pour le transport vers le laboratoire et transféré dans un entrepôt congelé à � ଌ.

2.2. Dosage de la désoxyribonucléase

Des mesures d'activité désoxyribonucléase (DNase) ont été effectuées selon Yasuda et al. [29]. Le mélange réactionnel d'un ml se composait de 20 µg d'ADN de thymus de veau, 10 mM de MgCl2, 10 CaCl2, tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 et protéine 2� µg. Le changement d'absorbance à 260 nm a été suivi à des intervalles de 30 s. Une unité d'activité DNase a été définie comme la quantité d'enzyme qui augmente la D.O. 1,0 par min dans des conditions de dosage standard.

2.3. Purification de la DNase de l'intestin grêle du chameau

2.3.1. Préparation de l'extrait brut

L'extrait brut de DNase a été préparé par homogénéisation de 5 g d'intestin grêle de chameau dans 15 ml de tampon Tris HCl 20 mM, pH 7,0 à l'aide d'un homogénéisateur. L'homogénat a été centrifugé à 10 000 g et le surnageant a été désigné comme extrait brut. L'extrait brut a été soumis à une dialyse contre le même tampon.

2.3.2. Chromatographie sur colonne

Le dialysat a été appliqué directement sur une colonne de diéthylaminoéthanol (DEAE)-Sepharose (10'x000a0'x000d7'x000a01,6'' d.l.) pré-équilibrée avec le même tampon. Le matériau adsorbé a été élué avec un gradient progressif de NaCl allant de 0,0 à 0,2 M préparé dans le même tampon à un débit de 30�a0 ml/h et des fractions de 3 ml ont été recueillies. Les fractions regroupées (0,2 M NaCl) avec l'activité spécifique la plus élevée de la DNase ont été concentrées par dialyse contre du saccharose solide et appliquées sur une colonne Sephacryl S-200 (90 ×ਁ.6਌m id) préalablement équilibrée avec le même tampon et développé à un débit de 20 ml/h, et des fractions de 3,0 ml ont été recueillies.

2.4. Détermination des protéines

Les protéines ont été quantifiées par la méthode de Bradford [4]. L'albumine de sérum bovin a été utilisée comme protéine standard.

2.5. Détermination du poids moléculaire

Le poids moléculaire a été déterminé par une technique de filtration sur gel en utilisant Sephacryl S-200. La colonne (90 ×ਁ.6਌m i.d.) a été calibrée avec du cytochrome C (12 400), de l'anhydrase carbonique (29 000), de l'albumine de sérum bovin (67 000), de l'alcool déshydrogénase (150 000) et β-amylase (200 000). Le bleu de dextran (2 000 000) a été utilisé pour déterminer le volume de vide (Vo). Le poids moléculaire de la sous-unité a été estimé par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide [10]. phosphorylase b dénaturée par SDS (94 000), albumine de sérum bovin (67 000), ovalbumine (43 000), anhydrase carbonique (30 000), inhibiteur de trypsine de soja (20 000) et α-lactalbumine (14 200) ont été utilisées pour la courbe d'étalonnage.

2.6. Caractérisation de la DNase 3

L'effet du pH sur l'activité de la DNase 3 a été déterminé dans la plage de pH de 4,5 à 9,0 en utilisant un tampon d'acétate de sodium 50 mM (pH 4,5𠄶.0), un tampon de phosphate de sodium (pH 6,5𠄷.5) et Tris- Tampon HCl (pH 7,0𠄹.0). La température optimale pour l'activité de la DNase a été déterminée en incubant les mélanges enzyme-substrat à différentes températures (10 ° 0201380 (x000a0 ଌ) dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0. La stabilité thermique de la DNase a été mesurée en termes d'activité résiduelle après incubation de la DNase à différentes températures (10� ଌ) pendant 1 h avant l'ajout du substrat. La valeur Km a été déterminée à partir du tracé de Lineweaver-Burk en utilisant des concentrations d'ADN de 20 à 100 µg. L'effet des cations métalliques sur l'activité DNase a été étudié en préincubant l'enzyme avec 10 mM Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Hg 2+ , Ba + , Cd 2+ et Ni 2+ pour une heure avant l'ajout du substrat.


Purification d'anticorps à l'aide d'agarose de protéine A, de protéine G ou de protéine L

Ce protocole est conçu comme une méthode de purification rapide pour les anticorps provenant de sérums de mammifères, d'ascites et de surnageants de culture cellulaire. Il convient de noter que si le matériel de départ est du sérum ou de l'ascite, la préparation finale contiendra des IgG endogènes de l'hôte ainsi que des anticorps spécifiques. En général, la présence de cette IgG endogène ne doit pas interférer avec les dosages utilisant les anticorps. La teneur en immunoglobulines de sérums normaux de plusieurs espèces et de sources d'anticorps monoclonaux est indiquée dans le tableau (PDF).

Noter: Nous proposons le kit PURE1A pour la purification des anticorps utilisant la protéine A.

Protocole de purification (pour une colonne de 1 mL)

Remarques: Ce protocole utilise un tampon de charge à haute molarité et pH élevé pour la protéine A afin d'améliorer la liaison des sous-classes avec une faible affinité pour la protéine A (telle que l'IgG1 de souris). La liaison aux protéines G et L a lieu à pH neutre, donc une solution saline tamponnée au phosphate est utilisée comme tampon de charge. L'élution de l'Ig liée est réalisée en une seule étape avec un tampon citrate, pH 3, qui élimine toutes les sous-classes qui se sont liées à la résine. La capacité de la protéine A et de la protéine G pour les IgG de diverses espèces peut être estimée à partir des affinités relatives données dans le tableau (PDF). Une sous-classe d'IgG avec 1-2 plus se liera à 1-5 mg d'IgG par ml de résine. Une sous-classe avec 3-4 avantages se liera à 10-25 mg par ml de résine. La protéine L est capable de lier toutes les classes d'Ig et peut lier 3 à 10 mg d'Ig par ml de résine pour les espèces avec 4 avantages. Il est recommandé que la résine à utiliser ait au moins 2 avantages pour l'espèce et la classe Ig du matériau à purifier.

Réactifs et équipement

  1. Surnageant de sérum, d'ascite ou de culture cellulaire
  2. Tampon de chargement de la protéine A : phosphate de potassium 1 M, pH 9,0
  3. Tampon de chargement de protéine G ou L : solution saline tamponnée au phosphate 0,01 M (PBS), pH 7,4 (produit n° P4417)
  4. Tampon d'élution : acide citrique 0,1 M, pH 3,0
  5. Base Tris 1,5 M, pour la neutralisation de l'éluat
  6. 3 - Seringue de 5 ml (manchon de colonne), laine de verre
  7. Robinet Luer-Lock (No de produit S7396)
  8. Support de bague, pince
  9. Tubes à essai, rack
  10. Spectrophotomètre, cuvettes
  11. pH-mètre
  12. Pipettes de transfert, bulbes
  13. Béchers, barreaux d'agitation et plaque d'agitation (pour la préparation du tampon)
  14. Unités de filtration stériles (en option)
  15. Azoture de sodium (conservateur) (Produit n° S2002)

Procédure

  1. Préparez des tampons. Les tampons peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 à 2 semaines. La filtration à travers des unités de filtration stérile prolongera la durée de vie des tampons, mais n'est pas nécessaire.
  2. Préparez le manchon de colonne. Retirez le piston de la seringue et jetez-le. Pressez une petite quantité de laine de verre dans le fond de la seringue, assez pour former un coussin d'environ 1/2 à 1 cm d'épaisseur. Fixez le robinet. Rincer avec 1 à 2 ml de tampon de charge. Assurez-vous que le coussin en laine de verre reste fermement au fond de la seringue.
  3. Suspendre la résine dans 2 ml de tampon de chargement en inversant et en tournant la bouteille. Évitez les secousses excessives. Ne pas vortexer le lisier.
  4. Verser la bouillie dans la seringue. Laisser l'excès de tampon s'écouler, puis laver la colonne avec 5 ml de tampon de charge. Ne laissez pas la résine sécher complètement.
  5. Si possible, estimez la quantité d'Ig dans le sérum, l'ascite ou le surnageant à charger. Si la quantité d'Ig n'est pas connue, le tableau (PDF) contient des niveaux approximatifs d'Ig dans le sérum de différentes espèces, dans l'ascite de souris et dans le surnageant de culture cellulaire qui peuvent être utilisés pour estimer la quantité d'Ig dans le matériau de départ. Sur la base de la capacité de la résine pour les Ig à partir de l'espèce du matériau de départ (voir les notes ci-dessus) et de la quantité d'Ig dans le matériau de départ, calculez le volume à charger.

Noter: Il s'agit de valeurs approximatives, à utiliser uniquement comme guide initial. Les concentrations réelles d'Ig dans les fluides et la liaison aux résines varieront et les rapports optimaux du matériau de départ à la résine doivent être déterminés expérimentalement.


Description du programme

Protein Purification est un programme en ligne gratuit développé par le regretté (juin 2016) Dr Andrew G. Booth de l'Université de Leeds (http://www.agbooth.com/pp_ajax/) 1 . Le programme propose quatre mélanges de protéines de complexité variée à explorer : Easy3 (trois protéines), Example (six protéines), Default (20 protéines) et Complex (60 protéines). Les utilisateurs peuvent sélectionner l'une des protéines d'un mélange à purifier. Les techniques de séparation disponibles sont le fractionnement au sulfate d'ammonium, le traitement thermique, la filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie d'interaction hydrophobe et la chromatographie d'affinité. Dans chacune de ces techniques, les utilisateurs peuvent modifier divers paramètres. Dans le cas de la chromatographie échangeuse d'ions, des milieux d'échange d'anions (Q-Sepharose et DEAE-cellulose) ou des milieux d'échange de cations (S-Sepharose et CM-cellulose) sont disponibles. Avec l'un ou l'autre, les utilisateurs définissent la méthode d'élution comme un « gradient de sel » ou un « gradient de pH ». Avec le gradient de sel sélectionné, les utilisateurs peuvent définir le pH du tampon d'équilibrage (2,0 à 11,0) et les concentrations de sel de début et de fin dans une plage de 0 à 3,0 m. Lorsqu'une technique de purification sur colonne est choisie, un chromatogramme FPLC apparaît qui affiche l'absorbance à 280 nm (UNE280) sur le primaire oui-axe, nombre de fraction sur le X-axis, et [sel] sur le secondaire oui-axe (voir Fig. 1). Bien qu'il ne soit pas utilisé dans notre exercice, le programme propose également des gels virtuels 1D et 2D (avec coloration au bleu de coomassie et immunoblot disponibles) qui permettent aux utilisateurs d'analyser les fractions d'une colonne. Le programme contient également une fonction d'aide qui comprend six exercices didactiques, mais la pratique avec ceux-ci n'est pas requise pour l'exercice décrit dans ce travail. Une recherche documentaire indique que deux publications utilisant le programme sont disponibles, et toutes deux proviennent de l'auteur du programme 1, 4 . Plus récemment, une applet Web qui simule une purification par échange d'ions de protéines surproduites à partir de E. coli a été décrit 5 . Cependant, nous avons décidé d'utiliser le programme conçu par le Dr Andrew Booth pour sa facilité d'utilisation et sa polyvalence qui s'étend aux techniques au-delà de la chromatographie d'échange d'ions 1, 4.

Captures d'écran des chromatogrammes FPLC utilisant le programme. Chaque simulation a utilisé le mélange « Easy3 ». Les astérisques indiquent l'emplacement de la protéine 1 avec le [sel] estimé requis pour l'élution donné. Les milieux d'échange d'ions, le pH d'équilibration et le gradient de sel variaient comme suit :

(A) Q-Sepharose, pH 6,0, 0-0,5 m de sel, (B) Q-Sepharose, pH 7,0, 0-0,5 m de sel, (C) Q-Sepharose, pH 8,0, 0-0,5 m de sel, (D ) Q-Sepharose, pH 10,0, sel de 0 à 0,5 m, (E) Q-Sepharose, pH 10,0, sel de 0 à 1,0 m, (F) DEAE-Cellulose, pH 10,0, sel de 0 à 0,5 m. Panneaux lettrés selon l'exercice (voir Informations complémentaires, page 3). [La figure en couleur peut être consultée sur wileyonlinelibrary.com]


Résumé

La purification d'une protéine est l'étape initiale essentielle dans l'étude de ses propriétés physiques et biologiques et est l'une des procédures les plus courantes en biochimie. Cet article décrit une méthode d'enseignement des compétences de purification par l'isolement partiel de la ferredoxine-NADP + réductase et de la ferredoxine à partir d'un seul lot de cellules. La méthode est utilisée depuis plusieurs années dans un cours d'introduction à la biochimie utilisant des feuilles d'épinard comme source cellulaire. Le protocole donne une image complète de la préparation d'un extrait brut et l'isolement ultérieur des deux protéines de transport d'électrons à l'échelle du laboratoire. Il initie les étudiants à l'utilisation de différentes techniques de purification et de détection de protéines et leur permet de développer un certain nombre de compétences expérimentales et analytiques précieuses sans nécessairement recourir à des équipements compliqués ou coûteux.

L'expérience en laboratoire aide les étudiants à développer leur esprit critique et leur créativité. De plus, en faisant des travaux pratiques, ils augmentent leur appréciation des mécanismes par lesquels les scientifiques obtiennent et analysent l'information. C'est en effet à travers la formation en laboratoire que les étudiants s'impliquent intensément et personnellement dans l'acquisition des connaissances. Sur la base de cette idée, nous avons développé ces dernières années une courte formation pratique sur la purification des protéines dans le cadre d'un cours de biochimie générale.

Les travaux biochimiques nécessitent fréquemment la purification d'un composé particulier à partir d'un mélange complexe. En effet, les protéines constituent l'un des candidats probables à être manipulés ou isolés par l'étudiant en biochimie au cours de son parcours professionnel. Comme modèle pour développer cette compétence, nous avons concentré notre intérêt sur la purification de la ferredoxine-NADP + réductase (FNR) 1 1 Les abréviations utilisées sont : FNR, ferredoxine-NADP + réductase DCPIP, 2,6-dichlorophénolindophénol. à partir d'épinards, ce qui permet en outre l'obtention de la protéine ferredoxine comme produit secondaire. Les deux protéines sont colorées (FNR est jaune et la ferrédoxine est brune), relativement abondantes dans le matériau de départ, faciles à manipuler et présentent des différences biochimiques prononcées, qui permettent aux étudiants de faire des comparaisons intéressantes.

FNR est l'enzyme contenant le FAD responsable de la photoréduction NADP + chez les plantes, les algues vertes et les cyanobactéries [ 1 ]. Il a été isolé de nombreuses sources et largement caractérisé. La masse moléculaire du FNR des épinards est de 36 000 Da, et son point isoélectrique est d'environ 5. La capacité du FNR à réduire des substrats artificiels tels que le 2,6-dichlorophénolindophénol (DCPIP) ou le ferricyanure (activité diaphorase) en utilisant le NADH ou le NADPH comme source d'électrons [2] permet une reconnaissance aisée de cette enzyme à n'importe quelle étape de la purification.

La ferrédoxine est une petite protéine porteuse d'électrons fer-soufre qui effectue le transfert d'électrons du photosystème I vers le FNR et est impliquée dans de nombreuses autres chaînes biologiques de transport d'électrons chez les cyanobactéries et les plantes et est également largement distribuée dans les bactéries [ 3 ].

En raison des caractéristiques particulières des deux protéines et de leur présence simultanée dans les feuilles d'épinard, une matière première peu coûteuse et facilement disponible dans le monde entier, nous considérons qu'il s'agit d'un excellent système pour enseigner les principes de la purification des protéines. Dans la pratique, l'étudiant est instruit dans le processus logique de purification, qui part d'une matière première en appliquant quelques étapes préparatoires de purification. Plus tard, la purification est affinée et la pureté du produit obtenu est évaluée. Dans le même temps, les étudiants sont formés à certains aspects biochimiques importants tels que (une) l'étude des propriétés spectrales d'une protéine, (b) la détermination de l'évolution dans le temps de la formation du produit dans un essai catalysé enzymatique avec calcul des unités d'activité, (c) la mesure de la concentration en protéines sur la base de valeurs obtenues à partir de données indirectes utilisant différentes dilutions, () la détermination du poids moléculaire d'une protéine par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, ou (e) l'élaboration d'un rapport écrit.

Cette pratique a été conçue pour être réalisée en peu de temps, et la préparation protéique obtenue n'est que partiellement purifiée. Cependant, nous expliquons que dans les séparations préparatives, l'objectif principal est d'isoler et de récupérer une quantité aussi grande que possible du composé à un degré de pureté élevé pour ensuite étudier sa chimie et/ou ses propriétés biologiques. Les étudiants apprennent également que toute procédure de purification adoptée entraînera inévitablement une certaine perte de matière et qu'il est essentiel que le nombre d'étapes de purification soit réduit au minimum, et donc les techniques utilisées doivent être celles qui sont capables de donner le plus grand rendement de purification. .

Afin d'apporter aux étudiants les bases d'une meilleure compréhension de cette pratique, elle est précédée d'une courte formation théorique sur les principes de la purification des protéines. De plus, les étudiants sont encouragés à lire et à en apprendre davantage sur les méthodes et l'analyse de purification des protéines dans les livres de laboratoire de biochimie disponibles à l'université. Nous utilisons principalement les textes de Wilson et Walker [ 4 ] et Boyer [ 5 ]. L'élaboration de ces travaux pratiques s'est révélée très utile pour poser des questions dont la finalité est d'inciter les élèves à réfléchir sur ce qui est observé et de stimuler l'imagination de l'élève. Nous avons vérifié que cela constitue une bonne méthode pour un enseignement didactique des sciences.


Plateforme d'expression et de purification des protéines

L'installation de production et de purification de protéines est un service et une ressource de base pour surmonter le principal goulot d'étranglement dans l'expression et la purification des protéines recombinantes. Nous fournissons principalement des conseils et un soutien actif aux chercheurs de la communauté scientifique dans l'utilisation du système d'expression procaryote et eucaryote pour la production de protéines recombinantes.

L'installation offre des équipements et des matériaux nécessaires à l'expression de protéines dans des cellules bactériennes, de levure, d'insecte (baculovirus) et de mammifère. Nous pouvons exécuter le processus complet de clonage, d'expression, de mise à l'échelle et de purification ou des tâches spécifiques au sein du projet.

Nous avons optimisé différents vecteurs d'expression en combinaison avec diverses souches bactériennes, souche de levure, souche d'insecte et cellule de mammifère pour l'expression spécifique de différents types de protéines.

Mission

La Protein Expression Facility est une plateforme payante dédiée à la fourniture d'une assistance technique dans les domaines suivants :

  • Conseils et formation
  • Ingénierie de l'ADN recombinant
  • Expression de protéines recombinantes dans les bactéries et les levures
  • Expression de protéines recombinantes via des systèmes d'expression de baculovirus (BVES)
  • Expression de protéines recombinantes dans les cellules de mammifères
  • Purification des protéines
  • Production d'anticorps polyclonaux

Prestations de service

La plateforme possède une expertise pour produire et purifier tout type de protéine. Pour chaque projet, nous avons utilisé l'organigramme suivant :

  • Conception d'amorce et clonage de vecteur d'expression
  • Développement des souches
  • Criblage d'expression
  • Fabrication et épuration

Autres services

  • Préparation et distribution de vecteur d'expression recombinant
  • Développement de nouveaux vecteurs pour fournir des technologies d'expression de pointe
  • Maintien de stocks congelés de baculovirus recombinant
  • Développement de la technologie de purification des protéines
  • Développement d'un catalogue de protéines recombinantes et d'enzymes de biologie moléculaire

Équipements

Fermenteur pour la culture cellulaire et la production de protéines
Système de chromatographie : pour la purification des protéines
Perturbation cellulaire : extraction de protéines
Culture de cellules d'insectes pour la production de protéines
Production de système d'hybridome
Akta flux pour la concentration de l'échantillon

Réseau et collaboration

P4EU : (Protein Production and Purification Partnership in Europe) initiative de réseau

Collaboration avec la plateforme Recombinant Platform de l'Institut Pasteur

Entraînement

L'installation fonctionne comme un centre de formation pour les étudiants et les scientifiques en clonage de gènes et en production de protéines recombinantes.


Stratégies de purification des protéines

Les protéines sont des macromolécules biologiques qui maintiennent l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la cellule, et de nombreuses maladies sont associées à un dysfonctionnement des protéines. La purification des protéines est une étape fondamentale pour analyser les protéines individuelles et les complexes protéiques et identifier les interactions avec d'autres protéines, ADN ou ARN. Il existe une variété de stratégies de purification de protéines pour répondre à l'échelle souhaitée, au débit et aux applications en aval. L'approche optimale doit souvent être déterminée empiriquement.

Purification des protéines

Le meilleur protocole de purification de protéines dépend non seulement de la protéine à purifier, mais également de nombreux autres facteurs tels que la cellule utilisée pour exprimer la protéine recombinante (par exemple, cellules procaryotes contre cellules eucaryotes). Escherichia coli reste le premier choix de nombreux chercheurs pour la production de protéines recombinantes en raison de sa facilité d'utilisation, de sa croissance cellulaire rapide et de son faible coût de culture. Protéines exprimées en E. coli peuvent être purifiées en quantités relativement élevées, mais ces protéines, en particulier les protéines eucaryotes, peuvent ne pas présenter une activité protéique ou un repliement approprié. Les cellules de mammifères cultivées pourraient offrir une meilleure option pour produire des protéines de mammifères correctement repliées et fonctionnelles avec des modifications post-traductionnelles appropriées (Geisse et al. 1996). Cependant, les faibles niveaux d'expression des protéines recombinantes dans les cellules de mammifères en culture présentent un défi pour leur purification. En conséquence, l'obtention d'un rendement et d'une pureté satisfaisants dépend d'une capture hautement sélective et efficace de ces protéines à partir des lysats cellulaires bruts.

Pour simplifier la purification, les étiquettes de purification par affinité peuvent être fusionnées à une protéine recombinante d'intérêt (Nilsson et al. 1997). Les marqueurs de fusion courants sont des polypeptides, de petites protéines ou des enzymes ajoutés à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine recombinante. Les caractéristiques biochimiques des différentes étiquettes influencent la stabilité, la solubilité et l'expression des protéines auxquelles elles sont attachées (Stevens et al. 2001). L'utilisation de vecteurs d'expression qui incluent une étiquette de fusion facilite la purification des protéines recombinantes.

Isolement des complexes protéiques

Un objectif majeur en protéomique est l'élucidation de la fonction des protéines et l'organisation des réseaux complexes qui sont responsables des processus cellulaires clés. L'analyse des interactions protéine:protéine peut fournir des informations précieuses sur les cascades de signalisation cellulaire impliquées dans ces processus, et l'analyse des interactions protéine:acide nucléique révèle souvent des informations importantes sur les processus biologiques tels que la régulation de l'ARNm, le remodelage chromosomique et la transcription. Par exemple, les facteurs de transcription jouent un rôle important dans la régulation de la transcription en se liant à des sites de reconnaissance spécifiques sur le chromosome, souvent au niveau du promoteur d'un gène, et en interagissant avec d'autres protéines du noyau. Cette régulation est nécessaire à la viabilité, à la différenciation et à la croissance cellulaires (Mankan et al. 2009 Mon Dieu et al. 1998).

L'analyse des interactions protéine:protéine nécessite souvent des méthodes simples pour immobiliser les protéines sur des surfaces solides dans des orientations appropriées sans perturber la structure ou la fonction des protéines. Cette immobilisation ne doit pas interférer avec la capacité de liaison et peut être réalisée grâce à l'utilisation de marqueurs d'affinité. L'immobilisation de protéines sur des puces est une approche populaire pour analyser les interactions protéine:ADN et protéine:protéine et identifier les composants des complexes protéiques (Hall et al. 2004 Salle et al. 2007 Hudson et Snyder, 2006). Les puces à protéines fonctionnelles contiennent normalement des protéines fonctionnelles pleine longueur ou des domaines protéiques liés à une surface solide. L'ADN marqué par fluorescence est utilisé pour sonder la puce et identifier les protéines qui se lient à la sonde spécifique. Les puces à protéines fournissent une méthode d'identification à haut débit des interactions protéine:ADN. Les protéines immobilisées peuvent également être utilisées dans des tests de pull-down de protéines pour isoler les partenaires de liaison aux protéines in vivo (cellules de mammifères) ou in vitro. D'autres applications en aval telles que la spectrométrie de masse ne nécessitent pas d'immobilisation des protéines pour identifier les partenaires protéiques et les composants individuels des complexes protéiques.


Purification, sensibilité redox et propriétés de liaison à l'ARN de la protéine de liaison SECIS 2, une protéine impliquée dans la biosynthèse des sélénoprotéines

Dans les ARNm de sélénoprotéine de mammifère, l'UTR 3' hautement structuré contient des éléments de séquence d'insertion de sélénocystéine (SECIS) qui sont nécessaires à la reconnaissance d'UGA en tant que codon de sélénocystéine. Nos travaux antérieurs ont démontré une étroite corrélation entre la lecture traductionnelle spécifique au codon et l'activité d'une protéine de liaison à l'ARN de 120 kDa qui interagissait spécifiquement avec l'élément SECIS dans l'ARNm de l'hydroperoxyde glutathion peroxydase phospholipidique. Cette étude rapporte la liaison à l'ARN et les propriétés biochimiques de cette protéine, SECIS-binding protein 2 (SBP2). Nous avons détecté une activité de liaison de SBP2 dans des extraits de foie, de cellules d'hépatome et de testicules à partir desquels SBP2 a été purifié par échange d'anions et chromatographie d'affinité d'ARN. Ce schéma nous a permis d'identifier un polypeptide de 120 kDa qui co-élue avec l'activité de liaison de SBP2 à partir de colonnes d'affinité d'ARN de type sauvage mais non mutantes. Une caractérisation des propriétés biochimiques de SBP2 révèle que la liaison de SBP2 est sensible à l'oxydation et à la présence d'héparine, d'ARNr et de poly(G). L'activité SBP2 est éluée avec une masse moléculaire d'environ 500 kDa lors de la chromatographie par filtration sur gel, suggérant l'existence d'un grand complexe fonctionnel. Des expériences de réticulation directe et de compétition démontrent que le site de liaison minimal de l'hydroperoxyde glutathion peroxydase 3' UTR de phospholipide se situe entre 82 et 102 nucléotides, ce qui est en corrélation avec la séquence minimale nécessaire à la lecture traductionnelle. SBP2 interagit également spécifiquement avec l'UTR 3' minimalement fonctionnel d'un autre ARNm de sélénoprotéine, la déiodinase 1.


Voir la vidéo: Les protéines et les enzymes (Août 2022).