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Pourquoi l'inhibition de l'initiation de la traduction provoque-t-elle l'accumulation de monosomes ribosomiques 80S ?

Pourquoi l'inhibition de l'initiation de la traduction provoque-t-elle l'accumulation de monosomes ribosomiques 80S ?


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Comme je l'ai lu dans (1), l'inhibition de l'initiation de la traduction augmentera le nombre de ribosomes 80S tout en diminuant la fraction de polysomes due au ruissellement des polysomes. L'effet net est de diminuer le rapport polysome/monosome (P/M) et nous l'observons par exemple en induisant un stress du RE par la tunicamycine dans (2).

Je comprends la réduction des polysomes - puisque nous n'interférons pas avec l'allongement, les polysomes fonctionnent normalement, finissant par tomber, mais les nouveaux monosomes ne peuvent pas passer au stade polysomal en raison de l'inhibition de l'initiation.

Cependant, pourquoi les ribosomes 80S s'accumulent-ils ? J'ai toujours pensé que le ribosome 80S est toujours lié à l'ARNm, sinon il se dissocie en sous-unités 40S et 60S distinctes. Cet effet signifie-t-il donc que la fraction 80S accumulée est exempte d'ARNm et donc que des « ribosomes 80S vacants », comme décrit en (1), peuvent exister ?

Merci beaucoup!

  1. https://books.google.co.uk/books?id=6sEq1xLu_hcC&pg=PA130&lpg=PA130&dq=polysome+translation+initiation&source=bl&ots=Un6JjImBJX&sig=ln9mn0KoJDJaVOGK8LbrEmMz9XE&hl=cs&sa=X&ei=x2JiVci8N4jX7Ab02YLgBQ&ved=0CGQQ6AEwCw#v=onepage&q=polysome%20translation% 20initiation&f=faux

  2. http://jcs.biologists.org/content/115/11/2443/F4.large.jpg">


    Cela dépendra du médicament que vous utilisez. Il existe une voie qui forme le complexe d'initiation de la traduction qui commence par la liaison de la coiffe de l'ARNm, la petite sous-unité scanne pour trouver l'AUG, puis la grande sous-unité se lie, et ainsi de suite. Les pics 80 S sur les gradients de densité ne sont pas vacants, ils sont en équilibre sur les ARNm en attente d'initiation (si vous avez supprimé l'inhibiteur).


    Mécanisme d'action de la streptomycine dans E. coli : interruption du cycle du ribosome à l'initiation de la synthèse protéique

    MÉCANISME D'ACTION DE LA STREPTOMYOCINE DANS E. COLI: INTERAPTION DU CYCLE RIBOSOME AU DÉBUT DE LA SYNTHÈSE DES PROTÉINES.

    Il existe plusieurs types d'antibiotiques dotés d'un mécanisme antimicrobien différent qui peuvent être utilisés contre les bactéries gram positives et négatives. Il existe également de nombreux types de classifications pouvant être utilisées afin de classer les antibiotiques. Certains de ces antibiotiques ont un effet bactérien à large spectre tandis que d'autres ont un effet bactérien à spectre étroit. Certains d'entre eux ont un effet bactéricide (ils tuent les bactéries) et d'autres ont un effet bactériostatique (ils inhibent la croissance ou la réplication bactérienne). Certains antibiotiques peuvent être à la fois bactéricides et bactériostatiques.

    Différents antibiotiques ont des modes d'action et des sites cibles différents au sein des cellules bactériennes. Il existe cinq mécanismes de base de l'action des antibiotiques contre les cellules bactériennes

    • Inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire
    • Inhibition de la synthèse des protéines (traduction)
    • Altération des membranes cellulaires
    • Inhibition de la synthèse des acides nucléiques
    • Activité antimétabolite

    L'inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire est le mécanisme le plus courant des antibiotiques. Les antibiotiques de deuxième classe montrent leur effet antimicrobien en inhibant le mécanisme de traduction dans la cellule. Dans l'article de Luzzatto et ses collègues, ils ont prouvé le mécanisme antimicrobien de la streptomycine sur Escherichia coli par l'article publié en 1968.

    Les antibiotiques inhibent la traduction dans la cellule de plusieurs manières. Ceux-ci sont

    1. mimétisme de l'ARNt
    2. Inhibiteurs de la formation osseuse peptidique
    3. Inhibiteurs de la liaison de l'ARNt au site A
    4. Inhibiteurs de la translocation
    5. Liaison à l'ARN 23S
    6. Liaison au ribosome 30S

    La streptomycine appartient à la classe des aminosides et est connue comme un inhibiteur de la synthèse des protéines.

    En 1964, dans une étude intitulée « Streptomycine, Suppression and the Code » menée par Julian Davies et Walter Gilbert, ils étaient conscients de la synthèse des protéines inhibant le pouvoir de la streptomycine, cependant, le mécanisme était inconnu. Des études antérieures de cette étude avaient suggéré que la streptomycine bloquait la synthèse des protéines en se liant fortement aux acides nucléiques. Julian Davies avait conclu que la streptomycine avait modifié les propriétés de codage. De plus, a fourni la preuve que les ribosomes contrôlent la précision de la lecture et peuvent avoir un rôle dans la suppression. Après cette étude, en 1968 Luzzatto a éclairci le mécanisme inconnu de la streptomycine inhibant la traduction par cette recherche.

    Dans l'article de Luzzatto, ils ont constaté qu'une certaine concentration (concentration létale) de streptomycine provoque l'accumulation de ribosomes 70S dans E. coli cellules. Ces ribosomes sont incapables de faire la traduction dans la cellule. Ces unités ribosomiques 70S qui se sont accumulées ont été appelées « monosomes de streptomycine ». De plus, ils ont découvert que ces unités consistent en un complexe de sous-unités 30S et 50S, d'ARNt, d'ARNm et de streptomycine. Ils ont observé que les sous-unités 70S qui constituent la streptomycine avaient des complexes d'initiation anormaux qui ne peuvent pas s'allonger, donc elles s'accumulent. Ainsi, ils concluent que les molécules de streptomycine "gèlent" en quelque sorte l'initiation de la protéine dans E. coli.

    Selon leurs découvertes, la streptomycine bloque la synthèse des protéines bactériennes au début. Une fois que les bactéries intactes sont exposées à la streptomycine, les polysomes s'épuisent rapidement et les particules 70S. « Les monomères de streptomycine » s'accumulent. Bien que la formation du complexe d'initiation ne soit pas affectée, le complexe formé en présence de streptomycine ne peut synthétiser de protéine et reste fixé en position. Il est proposé que les ribosomes au-delà du stade d'initiation soient capables de poursuivre leur mouvement et leur détachement de sorte qu'un complexe ribosomique 70S d'ARNm et d'unités 50S et 30S avec la streptomycine liée en résulte. En effet, le complexe d'initiation est congelé.

    Dans leur expérience, ils ont utilisé Escherichia coli mutant sud 24 et le cultiver sous forme fragile pour pouvoir le lyser et l'analyser lors des traductions. Pour tracer l'ARN pendant les traductions, ils ont utilisé des ARN radiomarqués. Ils ont mesuré la vitesse des molécules en utilisant une analyse de gradient de saccharose pour déterminer la distribution des tailles.

    Ils ont utilisé un dérivé résistant à la streptomycine (N21) et une souche AB301 sensible, un ARNt de transfert ala marqué et un ARNt F-met marqué, un ARNm naturel (f-met dépendant), un ARNm synthétique (poly AUG, f-met indépendant) et ils ont également utilisé utilisé une protéine de phage appelée R17.

    Au moment où ils ajoutent de la streptomycine, le ribosome était la forme 30S et 50S ainsi que lié à l'ARNm. Après des intervalles de 20 et 40 minutes, ils ont libéré (a) une diminution des gros polyribosomes et des particules libres 30S et 50S. (b) Accumulation de monomères 70S. (Fig. 1)

    La synthèse protéique dirigée par le phage R17 a été observée seule avec la streptomycine et la streptomycine a été observée seule sans le phage R17. Leur découverte avait montré que la streptomycine bloquait la fonction de l'ARNm naturel (fig. 2)

    La streptomycine a bloqué la synthèse d'ARN dirigée par l'ARNm naturel mais pas par l'ARNm synthétique. L'ARNm naturel initie la synthèse des protéines en utilisant f-met, mais l'ARNm synthétique ne nécessite pas le f-met pour démarrer la traduction. Ainsi, ils ont révélé que la streptomycine bloquait d'une manière ou d'une autre la limite f-met sur la sous-unité ribosomique 30S et bloquait le F-met à venir et s'attacher afin d'initier le processus de traduction. Cependant, l'expérience de l'ARN synthétique n'a pas bloqué en ajoutant la streptomycine. La quantité de S 35 f-met-ARNt a été réduite par la streptomycine et le H 3 -ala-tRNA lié aux ribosomes.

    Ils ont réalisé que la synthèse protéique initiée avec les ribosomes 70S n'était pas bloquée et se poursuivait lorsque la streptomycine était ajoutée, mais que seuls les nouveaux processus de traduction n'étaient pas initiés. Ainsi, en utilisant l'ARNm synthétique et naturel et également en utilisant un marqueur radioactif avec la connaissance de l'exigence f-met pour la traduction, ils ont pu comprendre que ce mode d'action de la streptomycine était à l'initiation juste après l'association des sous-unités ribosomiques.


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    Melero, R. et al. La structure cryo-EM du complexe UPF-EJC montre UPF1 en équilibre vers l'extrémité 3' de l'ARN. Nat. Structurer. Mol. Biol. 19, 498–505 (2012).

    Peltz, S. W., Brown, A. H. & Jacobson, A. La déstabilisation de l'ARNm déclenchée par une terminaison prématurée de la traduction dépend d'au moins trois cis-éléments de séquence agissants et un trans-facteur agissant. Gènes Dev. 7, 1737–1754 (1993).

    Narla, A. & Ebert, B. L. Ribosomopathies: troubles humains du dysfonctionnement des ribosomes. Du sang 115, 3196–3205 (2010).

    Draptchinskaia, N. et al. Le gène codant pour la protéine ribosomique S19 est muté dans l'anémie de Diamond-Blackfan. Nat. Genet. 21, 169–175 (1999).


    MATÉRIAUX ET MÉTHODES

    Reticulation d'affinité d'analogues d'ARNm contenant s 4 U avec des ribosomes humains

    Les sous-unités ribosomiques humaines 40S et 60S ont été isolées du placenta à terme, comme décrit dans (23). ARNt Phe purifié (∼ 80 %) et ARNt Val (∼ 70 %) de Escherichia coli étaient les gentils cadeaux du Dr V.I. Katunin (Institut de physique nucléaire de Saint-Pétersbourg nommé par B.P. Konstantinov du Centre national de recherche « Institut Kurchatov », Gatchina, Russie). Le transcrit Asp de l'ARNt de levure a été obtenu par transcription T7 in vitro, comme décrit ( 24). Modèles d'ADN pour la synthèse d'analogues d'ARNm avec des résidus s 4 U distribués de manière aléatoire par transcription T7 in vitro ont été obtenus par hybridation des paires d'oligodésoxyribonucléotides suivantes : F-Asp, 5′-aaattaatacgactcactatagggaagaaagaagataaagaaaaagaa-3′ et R-Asp, 5′-ttctttttctttatcttctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3′ata F-PheAspatacgggaacta-Asp, 5′-ttctttttctttatcttctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3′ata ′-tttttctttatcgaattctttcttccctatagtgagtcgtattaattt-3′ F-PheVal, 5′-aaattaatacgactcactatagggaagaaagaattcgtaaaagaaaaaaaaaaa-3′ et R-PheVal, 5′-tttttcttttacgaattctttcttccatta-Pheccata-3gtc-Catacgac-cagac-Catgac-ca-ca riche en C), 5′-gtggtggtgtacgaatggtggcttccctatagtgagtcgtattaatcg-3′. La réaction de transcription T7 a été réalisée comme décrit (25) les concentrations en UTP et s 4 UTP dans le mélange réactionnel étaient de 0,5 mM. Après la réaction, les ARN synthétisés ont été purifiés par PAGE dénaturant à 12 % et utilisés comme analogues d'ARNm. Il y avait 5′-GGGAAGAAAGAAGA 4 UAAAGAAAAAGAA-3′, 5′-GGGAAGAAAGAA 4 Us 4 UCG 4 UAAAAGAAAAA-3′, 5′-GGGAAGAAAGAA 4 Us 4 UCGA 4 UAAAGAAAAA-3′ et 5′-GGGAAGCCACCAs 4 Us 4 UCG 4 UACACC -3' désigné ci-après par ARNm I, II, III et IV, respectivement. Si nécessaire, les ARNm et les ARNt ont été déphosphorylés à l'extrémité 5' avec la phosphatase alcaline FastAP (Thermo Scientific) puis marqués à l'extrémité 5' au 32P en réaction avec le [γ-32 P]ATP et la polynucléotide kinase T4. Des complexes de ribosomes 80S avec des ARNm et des ARNt avec des interactions codon-anticodon soit au site P soit aux sites P et A simultanément, ont été obtenus selon (12). Les niveaux de liaison aux ribosomes 80S de l'ARNt Asp marqué au 32P ou de l'ARNt Phe apparenté à un triplet d'ARNm ciblé sur le site P pour former un complexe ternaire ou sur le site A pour convertir ce dernier en un quaternaire, et du les ARNm respectifs marqués au 32P ont été mesurés par un essai de filtration sur nitrocellulose comme décrit (12). Pour la réticulation dans les complexes ternaires avec les ARNm I-IV, les mélanges réactionnels comprenaient des ribosomes 80S (0,83 M), de l'ARNm marqué au 32 P (2 M) et l'ARNt (7 M) dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 ) contenant 100 mM de KCl, 13 mM de MgCl2 et 0,5 mM d'EDTA (tampon A). Pour la réticulation dans les complexes quaternaires avec les ARNm II et III, les mélanges réactifs respectifs ont été complétés avec l'ARNt approprié à sa concentration de 13 M. Après incubation dans des conditions de liaison (12), les mélanges ci-dessus ont été irradiés avec une lumière UV douce (λ > 300 nm) (26), suivi par une analyse des protéines ribosomiques réticulées dans 12% SDS PAGE comme décrit (12). L'identification des protéines ribosomiques réticulées a été réalisée sur la base de l'effet retardateur des fragments d'ARN réticulés sur la mobilité électrophorétique des protéines ribosomiques connues de nos travaux antérieurs (voir par exemple ( 7-9, 12, 14)).

    Culture de cellules et transfection

    Le minigène de FLAG uS19 amplifié à l'aide de l'ADNc HEK293 et ​​des amorces F (5′-acgtgaattcatggtggactacaaagacgatgacgacaaggcagaagtagagcagaag-3′) et R (5′-acgtgaattcttacttgagagggatgatgaagc-3′) a été inséré dans le vecteur pAGRI (26) sens avant. Le plasmide résultant pAG-1 (FLAG uS19) a été linéarisé par BamHI et ensuite utilisé pour transfecter des cellules HEK293 (ATCC CRL-1573) en utilisant la Lipofectamin LTX (Invitrogen). La sélection de clones cellulaires produisant de manière stable la protéine cible a été effectuée comme décrit (26). Des clones stables ont été testés pour leur capacité à produire FLAG uS19 après induction à la doxycycline (DOX) par western blot en utilisant anti-FLAG M5 (Sigma, #F4042) comme décrit (26).

    Analyse PAR-CLIP d'une lignée cellulaire stable produisant FLAG uS19

    La procédure PAR-CLIP a été réalisée selon ( 22) avec quelques modifications dans trois réplicats biologiques. Typiquement, des cellules HEK293 dérivées de pAG-1 (FLAG uS19) adhérentes dans quatre boîtes de Pétri de 15 cm ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS et 100 U/ml de pénicilline-streptomycine (tous de Thermo Fisher Scientific ) en CO2-incubateur (5% CO2) à 37°C. À 60-70% de confluence, la production de FLAG uS19 dans les cellules a été induite avec de la DOX (2 g/ml) et après 44 h, s 4 U a été ajouté à 250 M. Après 6 h, du cycloheximide a été ajouté à une concentration de 100 g/ml et les cellules ont été maintenues sur de la glace pendant 10 min, suivi d'un lavage avec du PBS glacé. La réticulation a été réalisée par irradiation des cellules avec de la lumière UV à 365 nm (0,5 J/cm2) dans Bio-Link (Vilber Lourmat) sur glace. Dans l'expérience témoin, s 4 U n'a pas été ajouté au milieu cellulaire et les cellules n'ont pas été irradiées aux UV. Enfin, les cellules ont été récoltées avec du PBS glacé et centrifugées à 1000 g.

    Le culot cellulaire a été lysé dans trois volumes de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 100 g/ml de cycloheximide et 0,02 U/μl de Turbo DNase I (Ambion)) pendant 10 min sur glace puis trituré 10 fois sur aiguille 29 G. Le lysat cellulaire a été clarifié par centrifugation à 20 000 g pendant 15 min à 4°C et le surnageant a été transféré dans un nouveau tube Eppendorf. La RNase I (Ambion) a été ajoutée à 1,3 U/μl, et le mélange réactionnel a été incubé à température ambiante pendant 45 min, suivi de l'ajout de SUPERase In inhibiteur de RNase (Thermo Fisher Scientific) à 0,35 U/μl. Le mélange a ensuite été clarifié comme décrit ci-dessus, et le surnageant (∼ 750 l) a été déposé sur 1 ml de coussin de saccharose à 30 % (contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 100 g/ml de cycloheximide et 0,02 U/μl de SUPERase In) dans un tube à centrifuger SW60. Le volume du tube libre a été complété par un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) contenant 150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 et 1 mM de DTT, et le tube a été centrifugé dans un rotor SW60 Ti à 25 000 tr/min pendant 16 h à 4°C. Le culot a été dissous dans 10 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) contenant 1% de SDS, incubé pendant 30 min à 37°C puis dilué 20 fois avec du tampon IP (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 % Nonidet P40 et cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma)). Le mélange a été clarifié comme décrit ci-dessus, et des anticorps anti-FLAG M2 (Sigma, #F1804) liés à des billes de protéine G magnétiques (Dynabeads, Life Technologies) ont été ajoutés au surnageant. Typiquement, 10 ug d'anticorps étaient liés à 40 ul de Dynabeads dans une expérience comme décrit (26). L'immunoprécipitation a été réalisée pendant 3 h à 4°C sur une plate-forme rotative et le surnageant a ensuite été éliminé. Les billes ont été lavées avec 1 ml de tampon IP (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,05 % Nonidet P40 et 0,5 mM DTT), trois fois avec 1 ml de tampon HS (50 mM Tris-HCl ( pH 7,5), 500 mM NaCl, 0,05 % Nonidet P40 et 0,5 mM DTT) et deux fois avec 1 ml de tampon Defos (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 et 1 mM de DTT). Les procédures restantes, y compris la déphosphorilation des fragments d'ARN réticulés au FLAG uS19, leur marquage à l'extrémité 5' avec [γ-32 P]ATP et la phosphorylation avec l'ATP ainsi que la séparation réticulée par SDS-PAGE suivie d'un transfert sur la membrane de nitrocellulose et l'isolement de fragments d'ARN réticulés, ont été effectués comme décrit (26).

    Séquençage NGS, traitement des données et analyse bioinformatique

    Les bibliothèques d'ADN ont été préparées selon ( 27) et séquencées avec 2 x 75 pb de réactifs à extrémités appariées sur MiSeq (Illumina) dans SB RAS Genomics Core Facility (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russie). Les lectures étaient démultiplexées par le script CEL-Seq ( 28). L'adaptateur et les séquences de faible qualité ont été supprimés à l'aide du logiciel TrimGalore v.0.5.0 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore). La cartographie de lecture a été réalisée par rapport au génome humain annoté Ensembl (GRCh38.93) avec le logiciel STAR v.2.6.1 (29). La déduplication BAM par index moléculaires uniques a été réalisée avec le script « déduplication » d'UMI-tools (30). Les transitions ont été trouvées par Basic Variant Detection dans le logiciel CLC GW v.12.0 (Qiagen) et filtrées par des scripts Python personnalisés. Les données de lecture rapportées dans cette étude ont été soumises au GEO sous le numéro d'accession GSE128265.

    Les sites de réticulation uS19 ont été détectés par l'apparition de transitions caractéristiques T/C (pour les supports d'ADN plus) et A/G (pour les brins d'ADN moins) dans les lectures de séquençage, qui ont été trouvées comme décrit ci-dessus, avec des paramètres : couverture minimale , 5 comptage minimum, 1 fréquence minimum, 1%. Les fichiers de format d'appel de variante (VCF) résultants ont été utilisés pour une analyse en aval ultérieure qui a été effectuée à l'aide des packages de la plate-forme R Bioconductor. Les positions génomiques des fichiers VCF ont été utilisées comme coordonnées des sites de réticulation et ont été annotées par des identifiants de transcription d'ensemble et des symboles de gènes HGNC à l'aide du package « biomaRt » (31) et de l'annotation d'ensemble GRCh38.93. Les coordonnées des transitions qui correspondaient à la partie non codante du génome et au génome mitochondrial ont été supprimées de la partie principale de l'analyse subséquente. Les positions génomiques ont été transformées en coordonnées CDS internes selon l'annotation Ensembl GRCh38.93. Les pics résultants ont été identifiés à l'aide des packages "chipseq" et "coverage view" et ont été mis en correspondance avec les positions des transitions mentionnées ci-dessus. Seuls les pics chevauchant des positions de transition et ayant une couverture supérieure au seuil ont été considérés comme des clusters de lecture. Parmi les positions de transition qui correspondaient à un cluster particulier, seule la position avec la couverture de transition T/C la plus élevée a été considérée comme le site de réticulation principal, le cas échéant.

    Les séquences CDS ont été téléchargées depuis Ensembl (www.ensembl.org/info/data/ftp/Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.fa) et les sous-séquences de –19 triplet en amont à +19 triplet en aval de la coordonnée CDS interne de transition ont été extraites. Compte tenu des cadres de lecture ouverts, les séquences résultantes ont été traduites en séquences d'acides aminés qui ont été utilisées pour l'analyse LOGO à l'aide de l'outil Weblogo (https://weblogo.berkeley.edu/). Les clusters de lecture ont été triés en fonction de la couverture totale en lecture du cluster, et les LOGO de contexte de transition ont été créés pour tous les clusters trouvés, y compris les 100 les plus couverts (« top100 »). Les histogrammes et les graphiques ont été construits à l'aide d'outils R intégrés.

    La corrélation entre les réplicats PAR-CLIP a été mesurée à l'aide de la fonction R standard (cor) et les graphiques résultants ont été générés à l'aide du package ggplot2. Pour comparer les lectures brutes les unes aux autres, des tables de corrélation de nombre de lectures ont été générées à l'aide de la fonction summaryOverlaps avec les paramètres par défaut du package GenomicAlignment (32). Pour tous les clusters identifiés, la couverture totale a été estimée à l'aide du package CoverageView, puis appliquée aux mesures de corrélation.

    Pour trouver des protéines avec (E/K)12 motifs, un ensemble de toutes les séquences de protéines humaines a été récupéré à partir d'Ensembl (https://www.ensembl.org/info/data/ftp/). Les séquences d'acides aminés ont été scannées pour la présence de l'un des 2 12 (E/K)12 motifs en utilisant le package Bioconductor Biostrings avec la fonction vcount-Pattern avec le paramètre max.mismatch égal à 4 et les autres paramètres par défaut.

    Profilage des ribosomes avec des cellules produisant FLAG uS19 et des cellules cultivées dans un milieu contenant s 4 U

    Pour le profilage des ribosomes avec des cellules HEK293 produisant FLAG uS19, des cellules HEK293 dérivées de pAG-1 (FLAG uS19) ont été cultivées en trois réplicats biologiques comme dans l'expérience PAR-CLIP. Pour la même tâche avec des cellules HEK293 cultivées en présence de s 4 U, les cellules ont été cultivées dans des boîtes de Pétri de 10 cm comme décrit ci-dessus dans trois réplicats biologiques jusqu'à 60% de confluence, puis s 4 U a été ajouté à la moitié de les boîtes de Pétri jusqu'à 250 M, suivies d'une incubation de 16 h et de la collecte des cellules. Les manipulations ultérieures, y compris la lyse cellulaire, le traitement à la RNase I du lysat et sa centrifugation à travers un coussin de saccharose étaient les mêmes que celles décrites ci-dessus. Avec des cellules HEK293 produisant FLAG uS19, le culot résultant a été solubilisé dans 200 l de tampon A et incubé avec 15 l de billes de protéine G pré-liées avec des anticorps anti-FLAG M2 pendant 3 h à 4°C suivi d'une séparation du surnageant de les perles. L'ARN total a été isolé de la fraction surnageante contenant des ribosomes avec uS19 endogène et des ribosomes restant sur billes et contenant uS19 FLAG en utilisant TRIzol (Ambion) selon le protocole du fabricant. L'ARN total du culot ribosomique obtenu après centrifugation du lysat cellulaire à travers un coussin de saccharose dans l'expérience avec des cellules HEK293 cultivées en présence de s 4 U a été isolé de la même manière. Les procédures ultérieures, y compris la sélection de la taille des fragments d'ARN et la purification, ont été effectuées conformément à (33). Des banques d'ADN ont été préparées et séquencées comme ci-dessus. Les données Ribo-seq correspondantes ont été soumises à la GenBank sous l'accession d'étude PRJNA563539 et l'accession d'échantillon SRP220276.


    Résumé

    L'expression des gènes est très précise et génère rarement des protéines défectueuses. Plusieurs mécanismes assurent cette fidélité, notamment des voies de surveillance spécialisées qui débarrassent la cellule des ARNm incomplètement traités ou dépourvus de cadres de lecture ouverts complets. L'un de ces mécanismes, la désintégration de l'ARNm à médiation non-sens, est déclenché lorsque les ribosomes rencontrent un codon de terminaison prématurée de la traduction - ou non-sens. De nouvelles preuves indiquent que les facteurs spécialisés qui sont recrutés pour ce processus favorisent non seulement la dégradation rapide de l'ARNm, mais sont également nécessaires pour résoudre un complexe de terminaison mal dissociable.


    MATÉRIAUX ET MÉTHODES

    Présentation du protocole

    Le profilage des polysomes sépare les ARNm traduits sur un gradient de saccharose en fonction du nombre de ribosomes liés. Tout d'abord, les cellules sont lysées et chargées sur un gradient de saccharose de 15 à 40 %. Après ultracentrifugation, le gradient est suivi à A254 à l'aide d'une Flow Cell couplée à un spectrophotomètre puis fractionnée en fractions égales : les ARNm non traduits (fractions du haut) sont séparés des ARNm associés aux polysomes (fractions du bas). Les fractions sont ensuite traitées pour l'extraction de l'ARN, soit manuellement par extraction acide au phénol-chloroforme, soit dans un format à 96 puits à l'aide d'un processeur de purification d'ARN automatisé, gérant simultanément plusieurs gradients. Le statut traductionnel d'une espèce d'ARNm donnée est analysé par amplification RT-PCR et sa quantification relative dans chaque fraction. Alternativement, le contenu des fractions polysomales peut être identifié à l'aide d'une analyse globale (telle que le séquençage à haut débit), donnant accès au translatome cellulaire. Un aperçu schématique de la méthode est présenté dans la figure 1.

    Présentation du protocole de profilage des polysomes pour analyser l'activité de traduction. Les différentes étapes du protocole impliquent (1) lyse cellulaire, (2) centrifugation sur gradient de saccharose et (3) fractionnement, (4) Extraction d'ARN et vérification de l'intégrité de l'ARN, (5) analyse du statut traductionnel des ARNm. Voir le texte pour plus de détails.

    Présentation du protocole de profilage des polysomes pour analyser l'activité de traduction. Les différentes étapes du protocole impliquent (1) lyse cellulaire, (2) centrifugation sur gradient de saccharose et (3) fractionnement, (4) Extraction d'ARN et vérification de l'intégrité de l'ARN, (5) analyse du statut traductionnel des ARNm. Voir le texte pour plus de détails.

    Protocole détaillé

    Collecte d'échantillons

    Des expériences ont été réalisées en utilisant Paracentrotus livide ou Sphaerechinus granularis oursins, les expériences présentées ici correspondent à P. livide échantillons. Des oursins ont été collectés dans les baies de Crozon ou de Concarneau (Bretagne, France). Les gamètes ont été obtenus par injection intracoelomique de 1 ml d'acétylcholine 0,1 M. Les œufs ont été collectés dans de l'eau de mer filtrée (FSW), filtrés sur gaze hydrophile et lavés deux fois dans FSW par centrifugation pendant 2 min à 2000 rpm (Heraeus, Labofuge 400 avec seaux oscillants). Les œufs ont été incubés 40 s dans du FSW additionné de 0,7 mM d'acide citrique pour éliminer la couche de gelée, et rincés à nouveau dans du FSW. Pour la fécondation, les œufs ont été mis en suspension dans du FSW sous la forme d'une suspension à 5 %. Le sperme a été collecté dans une boîte de Pétri et conservé à 4°C jusqu'à utilisation. Une dilution extemporanée dans du FSW (10 µl de sperme dans 1 ml de FSW) active le sperme pour la fécondation et 10 µl de ce sperme dilué ont été ajoutés par ml de suspension d'ovule. Les embryons ont été cultivés à 16°C sous agitation constante. Seuls les lots d'embryons présentant un taux de fécondation et de division supérieur à 95% ont été utilisés.

    Lyse cellulaire

    Les œufs ou les embryons ont été collectés dans FSW par une brève centrifugation (1 min à 1000 rpm, Heraeus, Labofuge 400 avec des seaux oscillants), et le culot a été remis en suspension dans quatre volumes de tampon de lyse froid (10 mM Tris pH 7,4 250 mM KCl 10 mM MgCl2 25 mM d'éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther)-N,N,N',N'- acide tétraacétique (EGTA) 0,4% Igepal 5% saccharose Eau sans RNase et extemporanément 1 mM 1,4-Dithiothréitol (DTT) 10 g/ml d'aprotinine 2 g/ml de leupeptine 100 M d'émétine 40 U/ml d'inhibiteur de RNase). La lyse a été effectuée dans un homogénéisateur Dounce en utilisant 10 coups du pilon B serré. Toutes les étapes ont été réalisées à 4°C, sur glace ou en chambre froide.Le lysat a ensuite été centrifugé pendant 10 min à 13 000 tr/min dans une centrifugeuse de table pour éliminer les noyaux et les débris cellulaires. Le surnageant a été soigneusement transféré dans un nouveau microtube. Les échantillons peuvent être congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80°C jusqu'à une utilisation ultérieure pour le fractionnement des polysomes.

    La concentration d'acide nucléique dans le lysat a été mesurée par absorbance à A260 nm d'un échantillon de 5 l de lysat dilué dans 1 ml d'eau à l'aide d'un spectrophotomètre. À partir de 10 6 œufs ou embryons dans un culot de 250 l, le rendement typique des échantillons d'oursins était généralement compris entre 20 et 40 OD.A260.

    Étapes critiques pour la préparation du lysat

    Le protocole décrit ci-dessus a été défini après optimisation de plusieurs paramètres tels que le matériel de départ (œufs congelés ou frais), la composition du tampon de lyse et les techniques de volume et de lyse. L'optimisation du protocole pour les ovocytes et les embryons d'oursins est détaillée ci-dessous, et la qualité de l'ARN dans le lysat a été testée pour chaque variante du protocole en utilisant l'extraction acide phénol-chloroforme et l'électrophorèse. Nous fournissons également des suggestions pour adapter ce protocole à d'autres modèles et organismes.

    Nous avons observé que la qualité de l'ARN s'améliorait lorsque les lysats étaient préparés avec des œufs frais plutôt qu'à partir d'une pastille d'œuf congelé conservée à -80°C (Figure 2, pistes A et B). Alternativement, la congélation et le broyage sous azote liquide avant la lyse fonctionnent pour les organismes à parois cellulaires ou pour les tissus solides (12, 25). Les lysats peuvent être conservés congelés à -80°C jusqu'à leur utilisation, sans perte détectable de l'intégrité de l'ARN.

    Qualité de l'ARN avec différentes conditions de lyse des œufs d'oursins. La lyse a été réalisée à l'aide d'une aiguille 25G (A–E) ou un homogénéisateur Dounce (F–J), sur des œufs congelés (A) ou des œufs frais (B–J). Le même volume (V) d'œufs a été lysé dans des volumes croissants de tampon de lyse allant de 2:1 à 1:4 (B–E). Un lavage supplémentaire avec de l'eau de mer filtrée FSW (G) ou SW sans Ca 2+ (H) a été testé avant la lyse. Le tampon de lyse contenait soit 1 mM d'EDTA (F) soit 25 mM d'EGTA (I et J). Deux quantités d'ARN préparées selon le protocole optimisé n'ont montré que les ARN 28S et 18S sans produits de dégradation (piste I : 250 ng piste J : 1 µg). Les ARN de chaque lysat ont été obtenus après une extraction acide au phénol-chloroforme et séparés sur un gel d'agarose à 2 %-TBE pour vérifier l'intégrité.

    Qualité de l'ARN avec différentes conditions de lyse des œufs d'oursins. La lyse a été effectuée à l'aide d'une aiguille 25G (A–E) ou un homogénéisateur Dounce (F–J), sur des œufs congelés (A) ou des œufs frais (B–J). Le même volume (V) d'œufs a été lysé dans des volumes croissants de tampon de lyse allant de 2:1 à 1:4 (B–E). Un lavage supplémentaire avec de l'eau de mer filtrée FSW (G) ou SW sans Ca 2+ (H) a été testé avant la lyse. Le tampon de lyse contenait soit 1 mM d'EDTA (F) soit 25 mM d'EGTA (I et J). Deux quantités d'ARN préparées en utilisant le protocole optimisé ont montré uniquement les ARN 28S et 18S sans produits de dégradation (piste I : 250 ng piste J : 1 µg). Les ARN de chaque lysat ont été obtenus après une extraction acide au phénol-chloroforme et séparés sur un gel d'agarose à 2 %-TBE pour vérifier l'intégrité.

    Le rapport du volume de la pastille d'œuf au tampon de lyse a été optimisé dans nos conditions pour obtenir un lysat suffisamment concentré pour une purification ultérieure des polysomes, sans compromettre la qualité de l'ARN (figure 2, voies B-E). Le rapport optimal était d'un volume de boulettes d'œufs pour quatre volumes de tampon de lyse (1:4 Figure 2, piste E). Les bandes inférieures étrangères observées dans les voies A, B, C et D correspondent aux produits de dégradation de l'ARN ribosomique 18S et 28S.

    Deux techniques de lyse ont été testées : le cisaillement mécanique à l'aide d'une aiguille 25G (utilisée en routine pour les lysats de protéines dans notre laboratoire) et l'homogénéisation Dounce. Dans nos expériences, l'utilisation d'un broyeur de tissus Dounce a amélioré la qualité de l'ARN (figure 2, voies E et F). A l'aide d'un Dounce de 7 ml avec le pilon B serré, qui laisse une distance de 20 à 55 µm entre le pilon et le cylindre, nous avons pu lyser des cellules sans casser le noyau pour isoler l'ARN cytoplasmique : le diamètre des œufs d'oursin est de 100 µm alors que le diamètre du noyau est inférieur à 20 µm. La bonne lyse des œufs a été vérifiée au microscope optique et 10 passages ont été nécessaires pour obtenir 100 % de cellules lysées.

    Les ovocytes et les embryons d'oursins contiennent une activité nucléase élevée qui dépend des ions Ca 2+ (26, 27), un rapport suggère de les rincer dans de l'eau de mer sans Ca 2+ avant l'étape de lyse pour améliorer l'intégrité de l'ARN (27). Dans nos mains et dans les espèces d'oursins que nous avons utilisées, cette étape n'a pas amélioré de manière significative la qualité de l'ARN (Figure 2, voies F-H). Cependant, l'inclusion d'EGTA dans le tampon de lyse (27) a amélioré la qualité de l'ARN et sa reproductibilité dans les lysats (Figure 2, cf. pistes F, I et J). Nous avons également remarqué que le tampon à haute teneur en sel préservait l'intégrité de l'ARN, donc 250 mM de KCl ont également été inclus dans notre tampon de lyse d'oursin.

    Pour générer des polysomes qui reflètent avec précision l'état de traduction de la cellule, le mouvement des ribosomes sur l'ARNm doit être minimisé pendant la préparation de l'échantillon pour empêcher efficacement les ribosomes de s'écouler de l'ARNm. Nous avons donc ajouté un inhibiteur d'allongement de la traduction. Le cycloheximide est l'inhibiteur le plus couramment utilisé dans les protocoles de profilage des polysomes décrits pour les cellules de mammifère (12). Dans les embryons d'oursins, le cycloheximide ne fonctionne pas, cependant l'émétine est un inhibiteur de synthèse protéique très efficace ( 28). Nous avons donc inclus l'émétine (100 M) dans des suspensions d'œufs ou des cultures d'embryons 5 min avant le prélèvement des échantillons, et dans le tampon de lyse.

    Une combinaison d'anti-protéases (aprotinine et leupeptine, par exemple) ou un cocktail anti-protéase disponible dans le commerce est nécessaire pour éviter la dégradation des protéines et améliorer la qualité des polysomes. Des détergents supplémentaires peuvent être inclus dans le tampon de lysat, tels que le Triton X-100 et le désoxycholate de sodium pour extraire les polysomes liés à la membrane dans les tissus de mammifères ou les cellules de culture (12, 29) ou le bromure de cétyltriméthylammonium dans les organismes contenant des polysaccharides (30). Plusieurs inhibiteurs de RNase peuvent être utilisés en combinaison pour inhiber complètement l'activité de la RNase, tels que l'héparine ou le complexe vanadyl ribonucléoside (12, 29). L'héparine, connue pour être un inhibiteur de la réaction RT-PCR, peut être éliminée en traitant les échantillons d'ARN avec de l'héparinase I (31). Dans nos expériences, nous n'avons utilisé qu'un inhibiteur de RNase commercial (de Promega), avec une sortie satisfaisante de l'ARN purifié des lysats d'oursins.

    Nous recommandons d'effectuer une vérification de l'intégrité de l'ARN cytoplasmique avant de procéder au fractionnement des polysomes. L'ARN a été purifié à partir d'une aliquote du lysat par extraction acide au phénol-chloroforme et résolu sur un gel d'agarose-Tris/Borate/EDTA (TBE) pour vérifier qu'il n'y avait pas de dégradation : les bandes d'ARN ribosomique apparaissaient sous forme de deux bandes nettes sur un gel d'agarose (voir Figure 2, voies I et J). La qualité peut être davantage déterminée sur un bioanalyseur. Le nombre d'intégrité de l'ARN, qui donne une mesure du degré de dégradation, devrait idéalement être proche de 10, correspondant à l'ARN intact ( Supplementary Data ).

    Fractionnement des polysomes

    Formation de gradient de densité de saccharose

    Les lysats obtenus comme décrit ci-dessus ont été chargés sur un gradient linéaire de densité de saccharose de 15 à 40 %. Deux tampons saccharose 15 et 40% ont été préparés dans 10 mM Tris pH 7,4 10 mM MgCl2 250 mM de KCl 25 mM d'EGTA 1 mM de DTT. Pour obtenir un gradient linéaire, nous avons utilisé le dispositif Gradient Master (BioComp) équipé de tubes adaptés pour un rotor SW41. Nous avons utilisé 6 ml de chaque tampon de saccharose dans chaque tube à gradient. Dans le tube d'ultracentrifugation, la solution légère de saccharose a été recouverte de la solution lourde de saccharose en utilisant une canule attachée à une seringue de 10 ml. L'introduction de bulles d'air ou le mélange des deux solutions doivent être soigneusement évités lors de cette étape. Le programme « SW41 Short Gradient » avec la plage correspondante de pourcentage de saccharose a été exécuté conformément aux instructions du fabricant. Ce programme dure quelques minutes (2 min 21 s pour un gradient de 15 à 40 %) et produit jusqu'à six gradients linéaires reproductibles en une seule fois. Les gradients doivent être manipulés avec soin pour éviter les perturbations et conservés à 4°C pendant au moins 1 h. Le pourcentage de saccharose utilisé pour les gradients linéaires peut être ajusté pour optimiser la séparation des fractions polysomales en fonction de l'échantillon biologique ou de l'expérience.

    Chargement des échantillons et ultracentrifugation

    Lorsque l'on compare deux conditions biologiques, la même quantité de lysat (DO équivalenteA260) doit être chargé au-dessus de chaque dégradé. Le volume maximum de lysat pouvant être déposé sur le gradient est de 500 l, avec un maximum de 25 ODA260. Dans nos mains, une meilleure séparation des pics 40S, 60S et du ribosome a été obtenue lorsque 10 ODA260 a été chargé sur le gradient, correspondant typiquement à 350 µl de lysat. Le chargement a été effectué en pipetant doucement le lysat sur le haut du gradient. Ensuite, les tubes à gradient ont été soigneusement équilibrés avant de commencer l'ultracentrifugation à 38 000 tr/min pendant 2,5 h dans un rotor Beckman SW41 Ti à 4°C. L'accélération a été réglée à sa valeur maximale, et pour éviter toute perturbation, la décélération a été réglée à sa valeur minimale. Une fois l'ultracentrifugation terminée, les gradients ont été maintenus à 4°C pour un fractionnement immédiat.

    Profil de gradient de polysome et collection de fractions

    Lors de l'ultracentrifugation, le système de fractionnement à gradient de densité Isco a été mis en place selon les recommandations du fabricant. Ce système de gradient de densité est équipé d'un spectrophotomètre avec un filtre de 254 nm (détecteur UV/VIS UA-6, Isco) et produit un profil d'absorbance continu au fur et à mesure que le gradient est collecté. Le fractionnement a été effectué en perçant le fond du tube centrifugé pour introduire une solution de chasse dense et augmenter le gradient intact par écoulement en vrac. Avant chaque expérience, l'ensemble du système a d'abord été lavé avec 0,1 M de NaOH, puis abondamment avec de l'eau traitée au DEPC. Dans nos expériences, la pompe péristaltique a été réglée à une vitesse correspondant à 0,9 ml/min.

    Après centrifugation, le tube de centrifugation a été connecté à une cellule d'écoulement et à l'appareil de perçage. La solution de chasse à 50 % de saccharose a été injectée en perçant le tube par le bas, en poussant le gradient de manière continue dans la cellule à écoulement. Les fractions ont été conservées sur de la glace pendant la collecte pour éviter toute dégradation de l'ARN. L'introduction de bulles d'air dans le système doit être évitée, car les bulles perturberont le gradient. Un profil de polysome typique (figure 3A) a d'abord montré un pic de A254 matériau absorbant, contenant les ARNm non traduits, puis les deux pics des petites et grandes sous-unités ribosomiques, le pic monosomique et enfin les pics polysomiques. Les profils des polysomes peuvent varier en fonction de l'activité de traduction générale. Par exemple, dans les œufs d'oursins non fécondés, <2% des ribosomes sont engagés dans des polysomes et les pics de polysomes sont à peine détectables (( 19) Figure 3A). Après la fécondation, l'activité de synthèse des protéines augmente et la proportion de ribosomes dans les polysomes augmente au fur et à mesure du développement (figure 3A).

    (UNE) Profil de gradient de polysome au début du développement. Profils de densité optique (ODA254) des profils de gradient de polysomes sont présentés, correspondant à des œufs non fécondés (UnF), des embryons post-fécondation 1 h (F) et des embryons au stade blastula tardif 30 h post-fécondation (Blastula). Les aires sous la courbe (AUC) des polysomes et des monosomes ont été mesurées, et le rapport polysome:monosome a ensuite été calculé pour les trois stades de développement, les barres d'erreur représentent le SEM et les statistiques ont été effectuées à l'aide de Student t-test (P-valeur < 0.01). (ÊTRE) Profils de gradient de polysomes et profils d'ARN correspondants après traitement avec des perturbateurs de polysomes. Profils de densité optique et ARN extraits de gradients de polysomes d'œufs fécondés (B), traités avec 30 mM d'EDTA (C), 2 mM de puromycine in vitro (D) et 0,6 mM de puromycine in vivo (E) sont affichés. Les ARN de chaque fraction de gradient de polysome ont été séparés sur des gels d'agarose-TBE à 2%.

    (UNE) Profil de gradient de polysome au début du développement. Profils de densité optique (ODA254) des profils de gradient de polysomes sont présentés, correspondant à des œufs non fécondés (UnF), des embryons post-fécondation 1 h (F) et des embryons au stade blastula tardif 30 h post-fécondation (Blastula). Les aires sous la courbe (AUC) des polysomes et des monosomes ont été mesurées, et le rapport polysome:monosome a ensuite été calculé pour les trois stades de développement, les barres d'erreur représentent le SEM et les statistiques ont été effectuées à l'aide de Student t-test (P-valeur < 0.01). (ÊTRE) Profils de gradient de polysomes et profils d'ARN correspondants après traitement avec des perturbateurs de polysomes. Profils de densité optique et ARN extraits de gradients de polysomes d'œufs fécondés (B), traités avec 30 mM d'EDTA (C), 2 mM de puromycine in vitro (D) et 0,6 mM de puromycine in vivo (E) sont affichés. Les ARN de chaque fraction de gradient de polysome ont été séparés sur des gels d'agarose-TBE à 2%.

    Purification d'ARN et profils

    Les ARN de chaque fraction ont été extraits avec un volume de phénol-chloroforme acide (vol:vol) et précipités avec un volume d'isopropanol. La précipitation à l'éthanol et à l'acétate de sodium ne peut pas être utilisée en raison de la concentration élevée de saccharose dans les dernières fractions. Les ARN ont été sédimentés dans une centrifugeuse de table à 13 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C, lavés avec de l'éthanol à 70 %, sédimentés à nouveau et séchés à l'air pendant 20 minutes. Les ARN de chaque fraction ont été remis en suspension dans le même volume d'eau sans RNase (un vingtième du volume de la fraction d'origine). Une aliquote de chaque fraction a été utilisée pour vérifier la qualité de l'ARN sur un gel d'agarose. Le profil de polysome des embryons fécondés et le profil d'ARN correspondant du gradient de saccharose de 15 à 40 % séparé sur un gel d'agarose sont illustrés à la figure 3B. Dans les premières fractions, seuls des ARN de faible poids moléculaire étaient visibles, puis des fractions contenant uniquement des sous-unités 40S ont été isolées comme le montre la présence de la bande ARNr 18S, suivi du pic 60S, comme le montre la bande ARNr 28S. Au milieu du gradient, les bandes étaient plus intenses, en raison de la forte proportion de monosomes. A partir de la fraction 13, les ARN 28S et 18S étaient présents avec un rapport 28S:18S égal à 2:1, représentant des fractions polysomales. En moyenne, à partir de 10 ODA260 chargé sur le gradient, les rendements d'ARN typiques étaient de 750 ng par fraction de polysome.

    Les protocoles recommandent souvent d'utiliser un traitement à la protéinase K avant l'extraction de l'ARN (10 mM de Tris pH 8, 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5 % de dodécyl sulfate de sodium et 200 μg/ml de protéinase K, pendant 25 min à 50 °C) pour améliorer la récupération de ARN de gradients de polysomes (32). Bien que cela puisse aider pour des échantillons spécifiques, entre nos mains, le traitement à la protéinase K n'a pas amélioré de manière significative la qualité ou la quantité d'ARN (données non présentées).

    Analyse du statut traductionnel des ARNm

    Un point critique des analyses de traduction est de vérifier que les ARNm présents dans les fractions de polysomes sont associés aux polysomes traduisants et ne se sédimentent pas simplement avec eux. Dans la cellule, les ARNm non traduits sont associés à des protéines de liaison à l'ARN dans ce qu'on appelle des ribonucléoparticules messagères (mRNP) ou à des polysomes bloqués, qui peuvent sédimenter dans les mêmes fractions que les polysomes lorsqu'ils sont purifiés sur des gradients de saccharose (19, 33). Pour faire la distinction entre les polysomes actifs et les mRNPs co-sédimentants ou les polysomes bloqués, nous avons traité nos échantillons avec un perturbateur de polysomes avant la purification des polysomes. Les deux perturbateurs couramment utilisés sont l'EDTA et la puromycine. L'EDTA chélate les ions Mg 2+ et dissocie les sous-unités du ribosome. L'EDTA (30 mM final) a été ajouté après la préparation du lysat, avant le chargement en gradient. Les gradients doivent également être complétés avec 10 mM d'EDTA et préparés sans Mg 2+. Étant donné que l'EDTA peut potentiellement affecter les mRNP, dont la formation peut dépendre du Mg 2+ , l'antibiotique puromycine est généralement préféré. La puromycine provoque la dissociation des ribosomes dans l'étape d'élongation de la traduction, et n'affecte que les polysomes actifs (34). La puromycine peut être ajoutée in vivo avant la lyse (0,6 mM dans une suspension d'œufs d'oursin ou une culture d'embryons) ou in vitro après la préparation du lysat (2 mM dans le lysat), lorsque les échantillons ne sont pas facilement disponibles pour la puromycine in vivo incubation (23, 35). Dans les deux cas, le lysat est additionné de 500 mM de KCl, incubé 15 min à 4°C puis 15 min à 37°C avant chargement sur gradient de saccharose (35).

    Le traitement à l'EDTA a perturbé le profil de gradient, avec une perte élevée d'intégrité de l'ARN (figure 3C). L'ajout de plus d'inhibiteur de RNase aux lysats et dans le gradient de saccharose a amélioré la qualité de l'ARN (données non présentées). En revanche, l'utilisation de la puromycine soit in vitro ou in vivo n'a pas affecté la qualité de l'ARN après purification. Les ARN des fractions de polysomes se sont déplacés vers des fractions plus légères dans les lysats traités à la puromycine (Figure 3D et E). Nous avons donc utilisé le traitement à la puromycine pour évaluer la traduction d'un ARNm spécifique.

    Après le profilage des polysomes et en utilisant les contrôles de puromycine en parallèle, le statut traductionnel d'un ARNm spécifique peut être évalué par Northern blot ou RT-PCR. La présence de l'ARNm peut être détectée dans chaque fraction, et après quantification du signal, la distribution d'ARNm spécifique a été exprimée en pourcentage du signal total. Une illustration de cette approche est donnée ci-dessous, en analysant le statut traductionnel des ARNm avant et après fécondation chez l'oursin.


    Discussion

    Ici, nous étudions la régulation traductionnelle des ARN dépendants de l'APC qui ciblent les protubérances cellulaires. Nous constatons que la position cytoplasmique des ARN dépendant de l'APC n'affecte pas leur traduction, car ils peuvent être traduits de la même manière dans les emplacements internes et périphériques. Au contraire, la traduction des ARN dépendants de l'APC est coordonnée avec des processus cellulaires périphériques spécifiques, étant activée lors de l'extension des protrusions/lamellipodes et supprimée lors de la rétraction de la protrusion. L'extinction est couplée à un changement de l'état physique des ARN qui se manifeste sous la forme d'ARN uniques se rassemblant en granules hétérogènes aux extrémités des protubérances.

    Ce mode de régulation est distinct de celui proposé pour plusieurs autres transcrits localisés, où les ARN sont transportés dans un état silencieux et ne sont activés en traduction qu'à l'atteinte de la destination finale ou à la réception de signaux spécifiques (Besse et Ephrussi, 2008 Buxbaum et al. , 2015 Jung et al., 2014). Une raison de ce dernier type de régulation a été proposée comme étant la nécessité d'empêcher l'apparition de protéines sur des sites, ou des moments, où elle pourrait être délétère. En effet, l'apparition prématurée du répresseur transcriptionnel Ash1p dans la cellule mère pendant le bourgeonnement supprime les programmes transcriptionnels à la fois dans les cellules mères et filles et empêche le changement de type d'accouplement (Long et al., 1997). De même, perturber le moment de l'activation traductionnelle dans les axones ou les dendrites neuronaux peut conduire à une recherche de chemin axonale aberrante ou à des réponses synaptiques (Colak et al., 2013 Holt et Schuman, 2013 Jung et al., 2012).

    Notre observation de la traduction indépendamment de la localisation cytoplasmique suggère que les protéines codées par les ARN APC-dépendants peuvent être produites dans les régions internes sans effets délétères. Nous proposons que ce mode de régulation pourrait en outre avoir des implications fonctionnelles pour les protéines codées. Plus précisément, la traduction dans des environnements locaux peut attribuer des protéines aux propriétés différentes. Cela pourrait résulter de modifications différentielles des protéines ou de la proximité de partenaires protéiques qui, lors de l'assemblage co-traductionnel, pourraient affecter le type ou l'efficacité de la formation de complexes multimères (Basu et al., 2011 Jung et al., 2014 Shiber et al., 2018 Shieh et al., 2015). À la lumière de ces idées, nous suggérons qu'un seul ARNm, tel qu'il est traduit en continu à différentes étapes de son transport vers la périphérie, pourrait donner lieu à des copies de protéines qui ont des propriétés différentes, et donc un potentiel fonctionnel, selon le micro-organisme local. -environnement dans lequel ils sont traduits.

    Nous montrons en outre que la traduction des ARN dépendant de l'APC est spécifiquement supprimée dans la rétraction des protubérances et ce silence est associé à la formation de clusters hétérogènes multimériques. La formation de ces amas est réduite par les traitements qui empêchent le transport de l'ARN vers la périphérie et est augmentée lors de l'inhibition de la traduction globale, suggérant que l'extinction est une étape limitante dans leur formation. Néanmoins, le silençage peut se produire en dehors des clusters, car une grande proportion d'ARN est observée sous forme de particules uniques dans des protubérances rétractables et silencieuses sur le plan de la traduction. L'apparition de ces amas hétérogènes d'ARN aux extrémités des protubérances, et leur relation avec la traduction, rappellent d'autres types de granules d'ARN formés par séparation de phase liquide-liquide (Courchaine et al., 2016 Weber et Brangwynne, 2012). Par exemple, les granules de stress (SG) et les corps de traitement (PB) sont des sites de concentration dynamique de molécules d'ARN, mais dans les deux cas, un silence ou une décroissance de la traduction peut se produire quelle que soit la localisation de l'ARN dans les granules (Halstead et al., 2015 Panas et al. , 2016 Perez-Pepe et al., 2018). Les SG et les PB se forment dans tout le cytoplasme dans des conditions normales ou en réponse à un stress. Une distinction intéressante des clusters décrits ici est que leur formation est induite dans des régions subcellulaires particulières associées à la rétraction de protrusion, suggérant que leur assemblage/désassemblage est contrôlé par des signaux spatiaux.

    L'extinction de Rab13, et probablement d'autres ARN dépendant de l'APC, au niveau des protrusions de rétraction est contrastée par leur activation traductionnelle dans l'extension des lamellipodes. Étant donné que la localisation des ARN dépendant de l'APC à la périphérie est importante pour la migration cellulaire (Wang et al., 2017), ces données pourraient indiquer un rôle fonctionnel pour la ségrégation spatiale de la traduction, de sorte que la production locale de protéines se produit dans des régions en extension active, tout en étant supprimée. dans les zones rétractables. Cela impliquerait l'existence d'un mécanisme de régulation dynamique qui coordonne la traduction d'ARN dépendante de l'APC avec les cycles continus de protrusion et de rétraction qui caractérisent la migration cellulaire (Ji et al., 2008 Tkachenko et al., 2011).

    Un mécanisme sous-jacent potentiel pour le silençage local et la formation de granules pourrait reposer sur des événements de phosphorylation/déphosphorylation spatialement restreints, qui se sont avérés affecter la propension des protéines de liaison à l'ARN à former des granules à phases séparées ou à se lier aux ARN (Monahan et al., 2017 Murray et al., 2017 Thapar, 2015). À cet égard, il est intéressant que les protéines associées aux ARN APC-dépendants incluent le régulateur traductionnel FMRP et la protéine de liaison à l'ARN FUS, l'une des protéines paradigmes utilisées pour comprendre les transitions de phase (Mili et al., 2008 Yasuda et al., 2017 Yasuda et al., 2013). Des modifications locales de FMRP ou de FUS pourraient sous-tendre la réglementation observée. Des événements locaux supplémentaires, y compris la maturation locale des miARN, pourraient être envisagés (Sambadan et al., 2017).

    En ce qui concerne la dynamique d'assemblage/désassemblage des amas périphériques et le sort des ARN séquestrés, les limitations de la durée d'imagerie en direct que nous pouvons accomplir ne permettent pas de conclusions concrètes. Cependant, nos données actuelles indiquent que l'étendue de la formation d'amas pourrait être influencée par le taux de rétraction. Plus précisément, dans les cellules NIH/3T3, la majorité des amas périphériques sont caractérisés par une accumulation visible de signal polyA, indiquant une forte concentration d'espèces d'ARN hétérogènes. En revanche, une fraction substantielle des saillies rétractables de MDA-MB-231 ne présente pas d'accumulation évidente de polyA (figure 9). Une différence importante entre les deux types de cellules est la vitesse à laquelle les protubérances se rétractent. Les saillies contractiles des cellules NIH/3T3 peuvent persister longtemps, tandis que les saillies du MDA-MB-231 se rétractent rapidement en quelques minutes (comparer les vidéos 11 et 12 à la vidéo 13). Bien que nous ne puissions pas exclure d'autres interprétations, telles que l'existence de transcrits déadénylés, nous privilégions l'idée que les protubérances à rétraction lente permettent l'accumulation de gros granules hétérogènes, tandis que dans les protubérances à rétraction plus rapide, les granules périphériques sont transitoires et se désassemblent rapidement soit par Dégradation ou libération d'ARN dans le cytosol.

    L'existence de clusters d'ARN multimériques silencieux sur le plan de la traduction offre également une explication potentielle de la légère diminution des ARN dépendants de l'APC trouvés dans la fraction RNP lourde dans des conditions qui perturbent le transport vers la périphérie (figures 1D et 2B). Les complexes RNP d'ordre supérieur silencieux sur le plan de la traduction peuvent sédimenter à des fractions de gradient de densité de saccharose plus lourdes que leurs homologues traduits (Chekulaeva et al., 2006). Par analogie, les amas périphériques d'ARN dépendant de l'APC représentent probablement une partie de l'ARN trouvé dans les fractions les plus lourdes du gradient. La réduction de leur formation lors du traitement par parthénolide (figure 10) pourrait probablement expliquer le déplacement apparent des ARN dépendant de l'APC vers la fraction polysome plus légère du gradient (figures 1D et 2B).

    Nous avions précédemment signalé que des ARN dépendant de l'APC pouvaient également être trouvés dans les granules cytoplasmiques internes induits par l'expression de mutants FUS porteurs de mutations associées à la SLA. Curieusement, dans ces granules FUS, les ARN dépendants de l'APC sont actifs sur le plan de la traduction (Yasuda et al., 2013). Prises ensemble, ces observations soulèvent la possibilité que, au moins pour les ARN dépendant de l'APC, leur partition physique en granules n'est pas le seul déterminant, mais agit en combinaison avec l'environnement local particulier pour déterminer l'impact éventuel sur leur statut de traduction. Il serait intéressant d'étudier plus en détail comment la composition des granules polyA périphériques diffère des autres granules d'ARN cytoplasmique internes en ce qui concerne à la fois les constituants ARN et protéines.

    Nous notons que l'étude ci-dessus décrit la régulation des ARN APC-dépendants dans la migration des cellules mésenchymateuses. Il serait intéressant d'explorer comment la traduction et le transport de ce groupe d'ARN s'effectuent dans des cellules plus grandes et plus stablement polarisées telles que les neurones.

    Dans l'ensemble, nous décrivons ici un mode distinct de régulation traductionnelle des ARN localisés. Ces résultats offrent une perspective différente pour comprendre comment la traduction locale peut influencer les activités des protéines et comment ces mécanismes de régulation pourraient être intégrés aux comportements cellulaires dynamiques.


    Résultats

    Très peu d'empreintes de ribosomes sur non épissé HAC1 ARNm

    Nous avons récemment rapporté des profils d'empreinte ribosomique améliorés (Ingolia et al., 2009) et des mesures d'abondance d'ARNm à partir d'une croissance exponentielle S. cerevisiae (Weinberg et al., 2016). Dans ces conditions de croissance HAC1 L'ARNm est presque entièrement non épissé (Figure 1 - supplément de la figure 1A) et est distribué sur un gradient de saccharose avec

    50% dans les fractions non-traductrices et le reste

    50 % s'étendant sur l'ensemble de la traduction (c.S et plus) fractions sans enrichissement substantiel dans une fraction particulière (figure 1A), similaire aux observations précédentes (Arava et al., 2003 Chapman et Walter, 1997 Cox et Walter, 1996 Kuhn et al., 2001 Mori et al., 2010 Park et al., 2011 Payne et al., 2008 Rüegsegger et al., 2001 Sathe et al., 2015). En revanche, l'actine bien traduite (ACTE 1) L'ARNm est essentiellement absent des fractions non traduisantes et se trouve principalement dans les grands polysomes. Basé sur la sédimentation de HAC1 mRNPs, nous avons prédit que l'ARNm générerait un grand nombre de fragments protégés par le ribosome, en quantité seulement

    2 fois moins que les ARNm également abondants (sur la base de la fraction de HAC1 ARNm dans les fractions non traduites). Étonnamment, cependant, après normalisation de l'abondance de l'ARNm HAC1 génère le moins de fragments protégés par le ribosome parmi tous les gènes de levure exprimés (Figure 1B) - et

    50 fois moins que prévu d'après le profil du polysome. Plutôt que de fournir des preuves de ribosomes bloqués sur HAC1 ou ARNm, ces observations suggèrent plutôt que l'un ou l'autre des ribosomes sont bloqués sur l'ARNm dans une configuration étroitement emballée qui empêche le clivage de la nucléase entre les ribosomes, ce qui éliminerait le

    Fragments de 28 nucléotides qui sont séquencés dans la méthode de profilage des ribosomes (figure 1C, milieu) ou qu'il n'y a pas de ribosomes bloqués sur HAC1 ou ARNm (figure 1C, en bas).

    Densité des ribosomes sur non épissé HAC1 ARNm.

    (UNE) Analyse polysome de HAC1 et ACTE 1 ARNm. Des extraits préparés à partir de cellules de levure en croissance exponentielle ont été fractionnés sur des gradients de saccharose de 10 à 50 %, avec une absorbance à 260 nm surveillée (en haut). Les distributions relatives de HAC1 et ACTE 1 Les ARNm à travers les fractions ont été déterminés par qRT-PCR (en bas). Montré sont la moyenne ± SEM avec m = 2 (c'est-à-dire la plage), exprimé comme une fraction de l'ARNm total détecté. (B) Histogramme des densités de ribosomes mesurées par profilage des ribosomes et RNA-seq. Le rapport entre le nombre de fragments protégés par le ribosome (RPF) et le nombre de lectures d'ARN-seq (nombre d'ARNm) a été calculé pour chacun des 4838 gènes de levure exprimés (données de Weinberg et al., 2016). Montré est la distribution des rapports log-transformés dans les bacs de 0,05, avec la position de HAC1 indiqué. (C) Scénarios possibles pour expliquer un manque de FPR. Alors qu'un ARNm avec une densité de ribosomes moyenne générera de nombreux

    28 nucléotides (nt) RPF (en haut), l'emballage serré de ribosomes empilés pourrait inhiber la digestion de la RNase entre les ribosomes nécessaires pour générer

    28 nt FPR (milieu). Alternativement, un ARNm qui ne contient pas de ribosomes de traduction ne générerait pas de RPF (en bas). () Analyse polysome de HAC1 Variantes d'ARNm avec des ORF raccourcis. Des mutations ponctuelles G-à-T ont été introduites dans le premier exon de HAC1 pour générer des codons d'arrêt prématurés, les ORF résultants étant représentés par des cases colorées épaisses (les 5'- et 3'-UTR constitutifs situés dans les exons 1 et 2, respectivement, sont représentés par de fines lignes noires, d'autres régions non traduites sont représentées par de fines cases colorées et les régions codantes des exons 1 (sarcelle) et 2 (violet) sont étiquetées comme 'HAC1 exon1' et 'exon2', respectivement). Le nombre maximal de ribosomes pouvant être hébergés a été calculé sur la base de chaque ribosome occupant 28 nt. L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans (UNE), avec des données pour le type sauvage HAC1 de (UNE) dupliqué pour comparaison. (E) Effets de l'héparine sur l'analyse des polysomes. Purifié non plafonné luciférase (luc) L'ARN a été ajouté au lysat ou au tampon de lyse en l'absence (–) ou en présence (+) de 0,2 mg/ml d'héparine. L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans (UNE) avec absorbance à 260 nm surveillée (en haut), et les distributions relatives des exogènes luc ARN (milieu) et endogène HAC1 et ACTE 1 Les ARNm (en bas dans le lysat uniquement) ont été déterminés. (F) Analyse polysome raffinée de HAC1 ARNm. Les extraits ont été préparés dans du tampon de lyse contenant de l'héparine à partir des souches indiquées dans (). L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans (UNE). (g) Analyse polysome de HAC1 ARNm pendant l'UPR. Souches montrées dans () ont été cultivés jusqu'à la phase logarithmique médiane et traités avec du DTT 8 mM pendant 20 min avant la récolte. Les extraits ont été préparés dans un tampon de lyse contenant de l'héparine et l'analyse des polysomes a été effectuée comme dans (UNE). Les lignes pointillées indiquent les fractions après lesquelles les ARNm mutants à code couleur correspondant ne devraient pas sédimenter en fonction de la longueur de l'ORF.

    Inhibition de l'initiation de la traduction révélée par les analyses de polysomes

    Bien que la sédimentation de type polysome de HAC1 ou L'ARNm indique l'association du ribosome, il ne révèle pas si les ribosomes associés à l'ARNm ont déjà été impliqués dans sa traduction. Alternativement, les ribosomes associés pourraient être liés dans une conformation qui n'est pas liée à la traduction de HAC1 ou ARNm. Nous avons donc conçu une expérience pour déterminer définitivement si les ribosomes liés à HAC1 ou L'ARNm reflète les ribosomes qui ont été impliqués dans sa traduction. Pour ce faire, nous avons profité du constat que HAC1 L'ARNm est distribué dans toutes les fractions de traduction d'un gradient de saccharose (figure 1A). Si la sédimentation profonde est due à plusieurs ribosomes de traduction bloqués sur un seul ARNm, la réduction du nombre de ribosomes de traduction pouvant tenir sur l'ARNm devrait déplacer le schéma de sédimentation vers des fractions plus légères. Nous avons conçu une série de constructions contenant des mutations ponctuelles dans le premier exon de HAC1 qui ont créé des codons de terminaison prématurés, qui réduisent la taille de l'ORF et limitent ainsi le nombre de ribosomes traduisants (figure 1D, en haut). Pour s'assurer que les allèles mutants étaient exprimés à des niveaux proches du type sauvage, nous avons remplacé les allèles endogènes HAC1 allèle sans perturber les régions régulatrices flanquantes. Remarquablement, chacun des ARNm mutants avait un schéma de sédimentation impossible à distinguer de l'ARNm de type sauvage (figure 1D, en bas). Dans le cas le plus extrême, l'ARNm contenant un ORF de 21 nucléotides qui ne peut accueillir qu'un seul ribosome de traduction encore co-sédimenté avec des polysomes contenant plus de 10 ribosomes (fraction 14 du gradient). Ces données fournissent une preuve directe que la sédimentation de type polysome de HAC1 ou L'ARNm n'est pas dû à des ribosomes bloqués sur l'ARNm.

    Nous avons émis l'hypothèse que l'association des ribosomes HAC1 ou L'ARNm était plutôt dû à des interactions non spécifiques entre l'ARNm et les polysomes authentiques formés sur d'autres ARNm. Pour évaluer l'étendue de ces interactions non spécifiques, nous avons introduit un ARN de contrôle exogène qui ne doit pas être traduit : un ARN codant pour la luciférase non coiffé purifié à partir d'une réaction de transcription in vitro. Nous avons analysé le comportement de sédimentation de cet ARN de contrôle lorsqu'il a été ajouté au tampon de lyse par rapport au moment où il a été ajouté au lysat de levure avant la centrifugation. Étonnamment, une partie de l'ARN exogène a été trouvée dans les fractions de traduction du lysat - un comportement non observé dans le tampon de lyse seul (figure 1E, milieu). Grâce à une optimisation poussée, nous avons constaté que l'ajout d'héparine au tampon de lyse (à une concentration de 0,2 mg/ml) était suffisant pour empêcher en grande partie la sédimentation profonde de l'ARN exogène. L'ajout d'héparine a également eu un effet majeur sur la sédimentation des HAC1 L'ARNm, comme la plupart (83 %) maintenant sédimenté dans les fractions non traduisantes du gradient (figure 1E, en bas). En revanche, la sédimentation de ACTE 1 L'ARNm (figure 1E, en bas) et le profil global du polysome (figure 1E, en haut) étaient en grande partie inchangés, ce qui suggère que l'héparine a éliminé les interactions non spécifiques sans perturber les polysomes authentiques.

    Sur la base de ces résultats, nous avons ré-analysé les HAC1 mutants avec des ORF raccourcis en utilisant un tampon de lyse contenant de l'héparine. Dans ces conditions, la co-sédimentation polysome de chacun des ARNm était fortement réduite (de

    50% à < 20%) mais il n'y avait toujours pas de différence entre les constructions (Figure 1F), fournissant une preuve supplémentaire contre les ribosomes bloqués sur HAC1 ou ARNm. Fait important, lorsque nous avons traité des cellules avec l'agent réducteur dithiothréitol (DTT) pour induire l'UPR et l'épissage concomitant de HAC1 ARNm (figure 1-figure supplément 1C) et répété l'expérience, les ARNm variants affichent maintenant la sédimentation différentielle attendue en fonction de la longueur de l'ORF (figure 1G), validant notre conception expérimentale. Ensemble, ces résultats démontrent qu'à l'état d'équilibre HAC1 ou L'ARNm n'est pas associé à des ribosomes activement allongés ou bloqués. Cela indique que le bloc primaire à la production de Hac1 up est au stade de l'initiation de la traduction, et non de l'allongement de la traduction comme proposé précédemment (Chapman et Walter, 1997 Richter et Coller, 2015 Rüegsegger et al., 2001).

    Un mécanisme de silence supplémentaire en aval de l'initiation de la traduction

    L'absence de ribosomes sur HAC1 ou L'ARNm suggère que l'initiation de la traduction est inhibée. Pour mieux comprendre le mécanisme de cette inhibition, nous avons utilisé un système rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) qui a déjà été montré pour récapituler le silence post-transcriptionnel par le HAC1 intron (Chapman et Walter, 1997 Rüegsegger et al., 2001). Nous avons remplacé le premier exon de HAC1 avec l'ORF GFP dépourvu de son propre codon d'arrêt (figure 2B), ce qui nous a permis d'analyser quantitativement l'extinction post-transcriptionnelle de la GFP en utilisant une combinaison de cytométrie en flux (abondance de protéines), de RT-PCR quantitative (abondance d'ARNm) et de fractionnement en gradient de saccharose (densité des ribosomes). Lorsque GFP a été intégré dans un autre type sauvage HAC1 contexte, l'ARNm s'est sédimenté presque entièrement dans les fractions non traduisantes (figure 2A), et il n'y avait pas de fluorescence détectable au-dessus du bruit de fond (figure 2C). En revanche, les cellules exprimant une construction de rapporteur manquant l'intron entier ont affiché un fort signal de fluorescence (figure 2C), et la plupart de l'ARNm a été trouvé dans les fractions de traduction (figure 2A). Ainsi, le journaliste GFP L'ARNm se comporte de la même manière que l'endogène HAC1 ARNm.

    Contribution de l'appariement de bases à longue distance à l'extinction dépendant des introns.

    (UNE) Analyse des polysomes des ARNm rapporteurs. Des extraits ont été préparés dans du tampon de lyse contenant de l'héparine à partir de souches exprimant la GFP ARNm rapporteurs représentés dans (B). L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans la figure 1A, avec des données pour le type sauvage HAC1 de la figure 1F dupliqué pour comparaison. (B) Conception d'ARNm rapporteurs. Les constructions sont représentées comme sur la figure 1D, la ligne pointillée indiquant une région supprimée. Les étoiles colorées indiquent des mutations dans la région d'appariement des bases, avec des changements de nucléotides spécifiques indiqués ci-dessous en rouge. (C) Analyse par cytométrie en flux de souches rapporteurs. Des souches exprimant la GFP ARNm rapporteurs représentés dans (B) ont été cultivés jusqu'à la phase mi-log et analysés par cytométrie en flux.L'intensité médiane de la GFP (normalisée à la taille des cellules) de la population cellulaire est représentée par rapport à la fluorescence de fond dans la souche de type sauvage (pas de GFP) avec des barres d'erreur indiquant les quartiles de la population cellulaire, le tout moyenné sur les réplicats (m = 2–7).

    Pour déterminer si l'appariement de bases 5'-UTR-intron est nécessaire pour empêcher le chargement de ribosomes sur l'ARNm rapporteur, nous avons conçu des constructions dans lesquelles la séquence impliquée dans les interactions d'appariement de bases dans la 5'-UTR ou l'intron a été mutée en son complément perturber l'interaction (figure 2B, en bas), comme cela a été fait précédemment (Rüegsegger et al., 2001). Les deux ARNm mutants se sont sédimentés principalement dans les fractions de traduction d'une manière similaire à la construction sans intron (figure 2A). Lorsque nous avons combiné les mutations 5'-UTR et intron et ainsi restauré l'appariement des bases, l'ARNm se trouvait maintenant presque exclusivement dans les fractions non traduisantes et ressemblait à l'ARNm rapporteur d'origine. Ces résultats démontrent que l'appariement de bases entre la 5'-UTR et l'intron est nécessaire pour empêcher le chargement du ribosome en empêchant directement la liaison ou la progression du ribosome de balayage.

    Étant donné que les ARNm mutants d'appariement de bases étaient chargés de ribosomes de la même manière que l'ARNm sans intron (figure 2A), nous nous attendions à observer l'expression de la GFP à partir des ARNm mutants qui était similaire à celle de la construction sans intron. Remarquablement, cependant, aucune des souches exprimant un ARNm mutant d'appariement de bases n'avait de GFP détectable par cytométrie en flux (figure 2C) ou immunoblot (figure 2 - supplément de la figure 1). L'absence de signal GFP malgré la sédimentation des polysomes n'était pas due à une faible abondance d'ARNm, car les ARNm mutants étaient présents à des niveaux similaires à ceux de l'ARNm sans intron (Figure 2 - supplément de la figure 1A, comparer la construction 3 avec les constructions 5-6). Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de silençage supplémentaire agissant en aval de l'initiation de la traduction empêche l'accumulation de GFP lorsque l'appariement des bases est interrompu.

    Silençage post-traductionnel par la queue C-terminale codée par l'intron

    En plus de supprimer la partie intron de l'interaction d'appariement de bases, l'épissage de HAC1 L'ARNm modifie également la queue C-terminale de la protéine codée : l'ORF dans HAC1 ou L'ARNm a une queue de 10 acides aminés codée par l'intron, qui dans HAC1 je L'ARNm est remplacé par une queue de 18 acides aminés codée par le deuxième exon (figure 3A). Le fait que les queues polypeptidiques codées par le HAC1 ou et HAC1 je Les ARNm sont différents, ce qui suggère que la queue de 10 acides aminés unique à Hac1 up peut être fonctionnellement importante. Nous avons donc émis l'hypothèse que la queue C-terminale codée par l'intron pourrait être impliquée dans le mécanisme de silençage supplémentaire révélé par nos reporters mutants d'appariement de bases (Figure 2).

    Silençage post-traductionnel médié par la queue C-terminale codée par l'intron.

    (UNE) Schéma de HAC1 épissage d'ARNm. Les protéines codées par HAC1 ou et HAC1 je Les ARNm diffèrent par leurs queues C-terminales, avec les séquences d'acides aminés indiquées. (B) Conception d'ARNm rapporteurs. L'ombrage noir indique le recodage, avec les séquences originales et recodées décrites ci-dessous (mutations en rouge). Les régions non traduites colorées en rouge correspondent à celles du TMA7 ARNm, avec le gène rapporteur intégré au TMA7 plutôt que HAC1 lieu. Sinon, les constructions sont représentées comme sur la figure 2B. (C) Analyse par cytométrie en flux de souches rapporteurs. Des souches exprimant la GFP ARNm rapporteurs représentés dans (B) ont été analysés comme dans la figure 2C, avec des données pour les trois premières souches dupliquées à partir de la figure 2B pour comparaison. () Analyse des polysomes des ARNm rapporteurs. Des extraits ont été préparés dans du tampon de lyse contenant de l'héparine à partir de souches exprimant la GFP ARNm rapporteurs indiqués dans (B). L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans la figure 1A, avec des données pour le type sauvage et sans intron GFP reporters de la figure 2A dupliqués à des fins de comparaison. (E) Différencier les mécanismes de silence co-traductionnels et post-traductionnels. À gauche : schéma de la construction rapporteur qui génère deux polypeptides distincts à partir de chaque cycle de traduction. À droite : des extraits ont été préparés à partir de souches exprimant des ARNm rapporteurs qui soit codaient pour la queue C-terminale de 10 acides aminés de Hac1 up (+queue) ou contenaient un codon d'arrêt juste avant la queue (-queue). L'immunobuvardage a été utilisé pour détecter mRuby HA-étiqueté (en haut) et GFP (en bas), avec l'actine comme contrôle de chargement. Deux réplicats biologiques sont présentés pour chaque génotype.

    Pour étudier cette possibilité, nous avons conçu une construction rapporteur dans laquelle nous avons supprimé l'intégralité de l'intron, à l'exception de l'extrémité 5' qui code pour la queue de 10 acides aminés de Hac1 up (figure 3B, quatrième construction). Remarquablement, les cellules exprimant cette construction n'avaient pas de GFP détectable (figure 3C), bien que l'ARNm correspondant soit abondant (figure 3 - supplément de la figure 1A) et détecté sur les polysomes en raison de l'absence de l'interaction d'appariement de bases (figure 3D). Ainsi, la région codante à l'extrémité 5' de l'intron est suffisante pour un silence complet du rapporteur GFP. L'introduction d'un codon de terminaison entre GFP et l'intron a restauré une fluorescence robuste comparable à celle observée pour la construction sans intron, ce qui impliquait la traduction de l'extrémité 5' de l'intron comme requis pour le silençage. De plus, faire 10 changements de nucléotides qui ont maintenu le potentiel de codage de la queue codée par l'intron (figure 3B, en bas) n'a eu aucun effet sur l'extinction (figure 3C), suggérant que la séquence d'acides aminés codée par l'extrémité 5' de l'intron est plus important que la séquence nucléotidique elle-même.

    Pour déterminer si l'élément 10-acide aminé seul était suffisant pour faire taire en l'absence de tout autre HAC1 séquences, nous avons exprimé GFP d'un locus différent dans le génome de la levure (TMA7) avec ou sans la queue de 10 acides aminés. Lorsque la séquence de 10 acides aminés était absente ou non traduite en raison d'un codon d'arrêt prématuré, nous avons observé un signal GFP robuste (figure 3C). En revanche, aucune fluorescence n'a été détectée dans les cellules exprimant la GFP contenant la queue de 10 acides aminés. Ainsi, la queue C-terminale de Hac1 u p est suffisante pour faire taire indépendamment du reste de la HAC1 intron et tout autre HAC1 séquences.

    Après avoir établi les effets de la queue de 10 acides aminés isolément, nous avons ensuite examiné les effets de la queue lorsque l'initiation de la traduction était inhibée par l'interaction d'appariement des bases. Dans un autre type sauvage HAC1 contexte, empêchant la traduction de la queue de 10 acides aminés soit en supprimant la séquence entière, soit en introduisant un codon d'arrêt, la GFP s'accumulait à des niveaux faibles mais détectables (figure 3C) sans affecter grandement la sédimentation des ARNm correspondants (figure 3D) . Ainsi, même lorsque l'appariement des bases est intact, il existe une accumulation de faible niveau de GFP qui est normalement supprimée par l'élément de silençage à 10 acides aminés.

    Dans le contexte des constructions de rapporteurs dépourvues de la queue C-terminale codée par l'intron, des mutations dans le 5'-UTR ou l'intron qui ont perturbé l'appariement des bases ont considérablement augmenté la quantité de GFP, tandis que la construction compensatoire à double mutant avec l'appariement de bases restauré n'avait que faibles niveaux de GFP (Figure 3C et Figure 3 - supplément de la figure 1B). Ces résultats sont en accord avec les précédentes expériences de rapporteurs GFP, qui utilisaient des constructions contenant un codon d'arrêt entre le GFP et des séquences d'intron et avait donc éliminé par inadvertance les effets de la queue de 10 acides aminés (Chapman et Walter, 1997 Rüegsegger et al., 2001).

    Ensemble, nos expériences de rapporteur GFP indiquent que le HAC1 l'intron médie le silence post-transcriptionnel via une paire de mécanismes indépendants mais partiellement redondants : des interactions d'appariement de bases avec la 5′-UTR qui inhibent l'initiation de la traduction, et un nouveau mécanisme de silence médié par la queue C-terminale codée par l'intron de Hac1 u p . Une expression robuste nécessite que les deux mécanismes de silençage soient inactivés, comme cela se produirait simultanément lorsque l'intron est supprimé par épissage dépendant d'Ire1p.

    Quel est le mécanisme par lequel la queue codée par l'intron de Hac1 up fait taire l'expression des gènes ? Parce que perturber la traduction de la queue a élevé les niveaux de protéines (figure 3C) sans affecter la formation de polysomes (figure 3D), nous avons déduit que la queue exerçait son effet en aval de l'initiation de la traduction. Nous avons donc estimé que la séquence de 10 acides aminés agissait soit en arrêtant la traduction à travers l'ensemble de l'ARNm (après la formation du polysome) soit en favorisant la dégradation des protéines. Notre incapacité à détecter la GFP contenant la queue de 10 acides aminés (figure 3C) nous a empêchés de comparer directement les demi-vies de la GFP avec et sans la queue. Au lieu de cela, pour faire la distinction entre l'allongement bloqué et la dégradation des protéines, nous avons conçu une construction de rapporteur qui génère deux polypeptides distincts à partir d'un seul cycle de traduction par le biais d'un «clivage» co-traductionnel médié par un peptide viral 2A (Sharma et al., 2012). Après criblage d'une séquence peptidique 2A qui fonctionne efficacement dans S. cerevisiae (Figure 3-figure supplément 2), nous avons conçu une construction contenant des séquences HA-mRuby et GFP séparées par le peptide P2A (dérivé du teschovirus-1). La séquence GFP en aval de P2A a été ajoutée à la queue de 10 acides aminés (ou n'était pas, comme contrôle), ce qui devrait conduire à l'absence de GFP détectable quel que soit le mécanisme d'action. En revanche, le mRuby marqué HA en amont ne doit être détecté que si la traduction elle-même n'est pas affectée par la séquence de 10 acides aminés, car elle rapporte le nombre de tours de traduction mais n'est pas liée de manière covalente à la queue inhibitrice. Le dosage de la GFP par immunotransfert a révélé que l'accumulation de la protéine était supprimée par la queue de 10 acides aminés, comme prévu (figure 3E). En revanche, HA-mRuby a été détecté à des niveaux similaires, que la queue soit ou non incluse dans la construction. Ces résultats indiquent que la queue fonctionne en aval de la traduction, probablement en agissant comme un « degron » (Varshavsky, 1991) qui cible la protéine pour une dégradation immédiate après la synthèse (Cox et Walter, 1996).

    Identification de DUH1 par une sélection génétique

    Si la queue C-terminale de Hac1 up fonctionne comme un degron, des protéines supplémentaires peuvent être impliquées dans la reconnaissance du degron et le ciblage de la protéine liée de manière covalente pour la dégradation. Pour identifier de telles trans-facteurs agissant, nous avons utilisé une approche génétique qui a profité du fort phénotype de silençage conféré par la queue de 10 acides aminés seule (figure 3C). Nous avons construit des souches dans lesquelles le premier exon de HAC1 a été remplacé par HIS3, dont nous avons pensé qu'il pourrait se comporter comme l'analogue GFP gènes rapporteurs et être complètement réduits au silence par la séquence de 10 acides aminés. Similaire à GFP, remplaçant le premier exon de HAC1 avec HIS3 mais en gardant le HAC1 le locus par ailleurs intact empêchait l'expression de His3p comme en témoigne l'auxotrophie de l'histidine (figure 4A). Le retrait de l'intégralité de l'intron a restauré l'expression de His3p et la croissance de la souche correspondante sur un milieu dépourvu d'histidine, suggérant que l'extinction était médiée par le HAC1 intron. Les souches contenant un codon stop entre HIS3 et l'intron (pour empêcher la traduction du degron à 10 acides aminés) avait un niveau de croissance faible mais détectable sur un milieu dépourvu d'histidine (figure 4A), cohérent avec le faible signal de fluorescence observé à partir du GFP construction de rapporteur (figure 3C). D'autre part, les souches contenant His3p attachées à la queue C-terminale de Hac1 u p mais aucun autre élément de la HAC1 l'intron n'a pas pu se développer sur un milieu dépourvu d'histidine. Ces résultats indiquent que le degron est suffisant pour le silence fonctionnel de HIS3 expression, fournissant un outil génétique utile pour identifier des gènes supplémentaires impliqués dans le mécanisme de silençage dépendant de degron.

    Identification de DUH1 par une sélection génétique.

    (UNE) Évaluation d'un rapporteur génétique pour le silençage intron-dépendant. Souches exprimant la valeur indiquée HAC1-basé HIS3 les ARNm rapporteurs (représentés comme sur la figure 2B) sans (–) ou avec (+) une étiquette HA N-terminale ont été cultivés jusqu'à saturation, et des séries de dilutions de 10 fois ont été étalées sur des supports SC ou SC-His. (B) Organigramme de la sélection génétique pour jj mutants. Après avoir sélectionné des mutants spontanés qui pourraient se développer sur un milieu dépourvu d'histidine, les clones réinsérés ont été filtrés pour cis mutants, vérifiés pour exprimer HA-His3p, et un sous-ensemble analysé par séquençage du génome entier. (C) Carte chromosomique des mutations identifiées par séquençage du génome entier. Chaque couleur correspond à un différent jj souche mutante. A droite se trouve le DUH1 lieu (YJL149W), avec les emplacements des changements de nucléotides (par rapport à DUH1 start codon) et les changements amino correspondants énumérés ci-dessous. () Effet de DUH1 perturbation de l'expression du rapporteur génétique. Souches exprimant les ARNm rapporteurs indiqués représentés dans (UNE) soit dans un DUH1 ou duh1∆ (deux clones indépendants) de fond ont été cultivés jusqu'à la phase logarithmique médiane. Des extraits ont été préparés et immunoblots pour le contrôle de charge HA-His3p et actine. (E) Analyse par cytométrie en flux de souches rapporteurs. Souches exprimant la valeur indiquée GFP les ARNm rapporteurs dans un DUH1 ou duh1∆ fond ont été analysés comme dans la figure 2C. Les données sont tracées comme dans la figure 2C (m = 2 pour toutes les souches).

    Bien que nous ayons initialement eu l'intention d'utiliser la mutagenèse chimique pour générer des mutants défectueux pour l'extinction, lors de l'élimination de la souche de sélection sur un milieu dépourvu d'histidine, nous avons remarqué qu'un petit nombre de colonies à croissance lente sont apparues même sans traitement mutagène. Nous avons pensé que de telles souches suppressives spontanées auraient très peu de mutations, ce qui permettrait d'identifier les mutations suppressives par séquençage du génome entier sans nécessiter de rétrocroisement ou de formation de groupes de complémentation. Ainsi, pour isoler des mutants avec un silençage dépendant défectif ('jj mutants '), nous avons simplement plaqué la souche de sélection exprimant His3p HA-étiqueté avec la queue de 10 acides aminés sur un milieu dépourvu d'histidine et isolé les rares colonies uniques qui se sont développées pour une analyse plus approfondie (figure 4B). À partir de cinq plaques indépendantes, nous avons isolé un total de 123 souches mutantes qui, une fois re-striées, pouvaient se développer sur un milieu dépourvu d'histidine. Le séquençage Sanger de la région C-terminale du gène rapporteur dans chaque mutant a identifié 15 souches abritant un cis mutation qui soit a modifié la séquence du degron, a introduit un codon d'arrêt prématuré avant ou dans le degron, ou a supprimé le codon d'arrêt du degron, ce qui a entraîné une extension C-terminale de six acides aminés (Figure 4 - supplément de la figure 1A) - tout cela a confirmé que la sélection génétique fonctionnait comme souhaité.

    Parmi les souches présentant une prototrophie à l'histidine, nous en avons sélectionné 35 (dont quatre cis mutants) à analyser par immunobuvardage et ont découvert que tous avaient un HA-His3p détectable (Figure 4 - supplément de la figure 1B). Nous avons sélectionné 20 de ces souches avec des mutations inconnues pour le séquençage du génome entier (ainsi que la souche de sélection parentale comme référence, et trois souches avec des mutations connues dans le degron comme témoins positifs pour notre procédure d'appel de variante), en prenant soin de sélectionner souches dont l'abondance ou le taux de croissance de HA-His3p variaient considérablement afin de minimiser nos chances de séquencer la même mutation dans plusieurs souches. Nous avons séquencé les 24 génomes ensemble dans une seule voie d'un séquenceur HiSeq à l'aide de lectures asymétriques de 50 nucléotides, ce qui a fourni une couverture de 38 à 74X (9,3 à 18,0 millions de lectures) de chaque génome de levure. Nous avons ensuite utilisé des outils standard de cartographie et d'appel de variantes (BWA et FreeBayes, respectivement) pour identifier les variantes absentes du génome parental, qui ont récupéré avec succès le contrôle positif. cis mutants. Remarquablement, 17 des 20 souches que nous avons séquencées contenaient une mutation dans le même gène YJL149W (Figure 4C et Figure 4—supplément de la figure 1C), et dans chaque cas, nous avons confirmé la mutation par séquençage de Sanger (Figure 4—supplément de la figure 1D). Étant donné qu'aucun autre ORF n'a été trouvé muté dans plus d'une des 20 souches mutantes (Figure 4—supplément de la figure 1C), nous avons concentré nos efforts de suivi sur YJL149W.

    YJL149W avait déjà été nommé DAS1 pour ' D st1-delta 6- A zauracile S ensitivity 1 ' lorsqu'il a été identifié dans un criblage génétique sans rapport avec l'UPR (Gómez-Herreros et al., 2012). Sur la base de la structure du domaine de la protéine (contenant un domaine F-box et des répétitions riches en leucine) et des interactions physiques avec les composants du noyau SCF Cdc53p et Skp1p (Willems et al., 1999), YJL149W a été annotée en tant que « protéine putative SCF ubiquitine ligase F-box » (Cherry et al., 2012). Les protéines F-box agissent comme des adaptateurs pour cibler les substrats pour l'ubiquitination et la dégradation ultérieure par le protéasome (Skaar et al., 2013). Nous proposons donc de renommer ce gène DUH1 pour ' Degrader of Unspliced HAC1 produit du gène 1' pour refléter son rôle dans la dégradation de Hac1 u p, comme nous le démontrerons plus loin.

    Les DUH1 les variantes que nous avons identifiées dans nos 17 souches comprenaient 16 mutations différentes, dont 8 étaient un non-sens, 7 étaient faux-sens et 1 était un décalage du cadre de lecture (figure 4C, à droite). Les mutations non-sens avaient tendance à se regrouper dans la première moitié de l'ORF, suggérant qu'elles fonctionnaient probablement comme des allèles nuls. De plus, trois des 17 souches contenant des mutations dans DUH1 ne contenait aucune autre mutation, impliquant le DUH1 mutations comme cause du phénotype. Nous avons donc testé si le knock-out DUH1 (ce qui n'est pas essentiel) dans la souche de sélection originale a récapitulé le phénotype de dé-silence. Perturber DUH1 a conduit à une augmentation spectaculaire de l'abondance à l'état d'équilibre de HA-His3p contenant la queue de 10 acides aminés, tout en n'ayant aucun effet sur HA-His3p dépourvu de la queue ou des constructions réprimées par l'appariement de bases à longue distance (figure 4D). De manière analogue, la suppression DUH1 dans les souches rapporteurs GFP ont complètement éliminé l'effet de silençage de la queue Hac1 up mais n'a eu aucun effet sur le silençage médié par l'appariement de bases (Figure 4E et Figure 4 - supplément de la figure 2). Notamment, en l'absence de DUH1 le reporter GFP dans un type sauvage HAC1 le contexte était maintenant exprimé au même niveau de fuite que précédemment vu pour le rapporteur dans lequel un codon d'arrêt était positionné entre GFP et l'intron, indiquant que l'extinction dépendant de degron est nécessaire pour supprimer l'expression de la GFP qui fuit. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves génétiques que DUH1 est la protéine adaptatrice qui reconnaît la queue Hac1 up et cible la protéine attachée de manière covalente pour la dégradation.

    Les effets de DUH1 sur l'abondance, la synthèse et le renouvellement de Hac1p

    Ayant établi que DUH1 est nécessaire pour le silençage dépendant de degron de deux gènes rapporteurs différents, nous sommes revenus à HAC1 lui-même. Pour détecter Hac1p, nous avons introduit une étiquette 3xHA à l'extrémité N terminale de l'endogène HAC1 allèle (Figure 5A), qui n'a pas interféré avec son silence post-transcriptionnel en l'absence de l'UPR (Figure 5B et C). Pour déterminer quelles isoformes Hac1p sont réglementées par DUH1, nous avons construit un ensemble de souches marquées HA qui ont produit de manière constitutive soit Hac1 ip contenant la queue codée par l'exon 2 de 18 acides aminés (construction 3), Hac1 up contenant la queue codée par l'intron de 10 acides aminés (construction 5) , ou Hac1 tail p ne contenant aucune queue (constructions 4 et 6). Tous les ARNm codant pour les variants Hac1p marqués HA ont été exprimés à des niveaux similaires en présence versus en l'absence de DUH1 (Figure 5B). Étonnamment, au niveau des protéines, seule l'abondance de Hac1 up a été affectée par la perturbation de DUH1, augmentant de

    cinq fois dans la souche knock-out (figure 5C). L'abondance accrue de Hac1 up en l'absence de DUH1 n'était pas due à une augmentation de la traduction, comme en témoigne la suppression de DUH1 n'ayant aucun impact sur la densité des ribosomes sur l'un des ARNm rapporteurs marqués par HA (figure 5D). Au lieu de cela, nos résultats suggèrent que Duh1p affecte spécifiquement le chiffre d'affaires de Hac1 up en raison de sa queue de 10 acides aminés, comme cela a été suggéré par les résultats de nos expériences de rapporteur.

    Les effets de DUH1 sur l'expression et la stabilité de Hac1p.

    (UNE) Conception de 3xHA-étiqueté HAC1 variantes d'ARNm. Les constructions sont représentées comme sur la figure 2B, avec l'emplacement du marqueur 3xHA N-terminal indiqué. (B) Mesures d'abondance d'ARN pour HAC1 variantes d'ARNm. L'ARN total a été extrait de souches exprimant les ARNm indiqués soit dans un DUH1 ou duh1∆ Contexte. La qRT-PCR a été utilisée pour mesurer les abondances de HAC1 variantes par rapport à ACTE 1 ARNm, avec toutes les données normalisées à l'abondance de la construction 1 dans la souche BY4741. Montré sont la moyenne ± SD (m = 2). (C) Effet de DUH1 perturbation sur les abondances de protéines. Souches exprimant les ARNm indiqués représentés dans (UNE) soit dans un DUH1 ou duh1∆ fond ont été cultivés jusqu'à la phase logarithmique moyenne. Des extraits ont été préparés et immunoblottés pour le contrôle de charge 3xHA-Hac1p et actine. () Analyse polysome de 3xHA-étiqueté HAC1 variantes d'ARNm. Des extraits ont été préparés dans du tampon de lyse contenant de l'héparine à partir de souches exprimant les ARNm indiqués en (UNE) soit dans un DUH1 ou duh1∆ Contexte. L'analyse des polysomes a été effectuée comme dans la figure 1A. (E) Analyse de la cinétique de dégradation des protéines. Souches exprimant la construction 5 (représentée dans UNE) soit dans un DUH1 ou duh1∆ fond ont été cultivés jusqu'à la phase médiane du log avant d'être traités avec du cycloheximide (CHX) pour arrêter la traduction. Aux moments indiqués, des aliquotes de cellules ont été trempées dans du méthanol refroidi à la neige carbonique et récoltées par centrifugation. L'extraction des protéines et l'immunotransfert ont été effectués comme dans (C), sauf qu'un anticorps de haute sensibilité a été utilisé pour détecter 3xHA-Hac1 u p. Montré sont la moyenne ± SD (m = 3), exprimé en fraction de protéine détectée à t = 0.

    Parce que nous avons pu détecter Hac1 up par immunoblot (à l'aide d'un anticorps de haute sensibilité) même lorsque DUH1 était intact (contrairement au rapporteur GFP correspondant), nous avons pu utiliser des expériences d'arrêt du cycloheximide (CHX) pour évaluer directement l'impact de DUH1 sur le chiffre d'affaires de Hac1 u p. Tant en présence qu'en l'absence de DUH1, Hac1 u p s'est dégradé si rapidement que nous n'avons pas pu mesurer avec précision sa demi-vie, même en utilisant une procédure de récolte rapide, en raison de la

    2 minutes sont nécessaires pour que CHX s'accumule dans les cellules et arrête la traduction (Gerashchenko et Gladyshev, 2014). Cependant, la cinétique de dégradation des protéines nous a permis de calculer une borne supérieure pour la demi-vie de Hac1 u p, qui était de 50 secondes lorsque DUH1 était présent (Figure 5E). Suppression de DUH1 stabilisé Hac1 up et augmenté sa limite supérieure de demi-vie à 2 minutes. Ces résultats démontrent que DUH1 est nécessaire pour la demi-vie extrêmement courte de Hac1 up qui limite normalement son accumulation. La vraie différence de demi-vie sur DUH1 la suppression est susceptible d'être supérieure à la

    Différence de 2 fois dans les limites supérieures que nous avons mesurées, sur la base de la

    Différence de 5 fois dans les niveaux de protéines à l'état d'équilibre qui ne pouvait pas être expliquée par des différences d'abondance d'ARNm ou de densité de ribosomes (Figure 5B et D).

    Synergie entre l'appariement de bases à longue distance et la dégradation dépendante de Duh1p

    Il a été précédemment observé que la perturbation de l'interaction d'appariement de bases entre la 5'-UTR et l'intron de HAC1 L'ARNm était suffisant pour permettre l'accumulation de Hac1 up, ce qui a conduit à un modèle dans lequel seul l'appariement de bases était responsable du phénomène de silençage post-transcriptionnel (Rüegsegger et al., 2001). Nos résultats utilisant des constructions dans lesquelles la région d'appariement de bases a été supprimée (figure 5) suggèrent que l'accumulation précédemment observée de Hac1 up était sans le savoir tamponnée par la dégradation dépendante de Duh1p. Pour traiter directement cette possibilité, nous avons généré des constructions marquées HA dans lesquelles la région d'appariement de bases a été perturbée par des mutations dans le 5'-UTR ou l'intron ou a été reconstituée par les mutations compensatoires (figure 6A) et a déterminé l'effet de DUH1 suppression sur les niveaux de protéines à l'état d'équilibre. Parce que les sites d'épissage 5' et 3' sont restés intacts dans ces constructions, nous les avons introduits dans un ire1Δ arrière-plan pour éliminer tout effet de confusion potentiel de l'épissage d'arrière-plan (Figure 1 - supplément de la figure 1B). Comme observé précédemment, la mutation de la région d'appariement des bases en présence de DUH1 a entraîné des niveaux détectables de Hac1 up (figure 6C). Cependant, l'accumulation de Hac1 up a été fortement stimulée par la suppression de DUH1, ce qui n'a pas été expliqué par une augmentation correspondante de l'abondance d'ARNm (Figure 6B et C). Ainsi, bien que la perturbation de l'appariement des bases produise des quantités détectables de Hac1 up comme indiqué précédemment (Rüegsegger et al., 2001), la dégradation dépendante de Duh1p restreint le niveau d'équilibre de la protéine.

    Relation entre l'appariement des bases et la répression dépendante de Degron.

    (UNE) Conception de 3xHA-étiqueté HAC1 variantes d'ARNm. Les constructions sont représentées comme sur la figure 2B. Les étoiles colorées indiquent des mutations dans la région d'appariement des bases, avec des changements de nucléotides spécifiques illustrés sur la figure 2B (étoiles rouges et bleues) ou ci-dessous (étoiles vertes et noires) en rouge. (B) Mesures d'abondance d'ARN pour HAC1 Variantes d'ARNm dans les arrière-plans de souche indiqués, analysés comme dans la figure 5B. (C) Effet de DUH1 perturbation sur les abondances de protéines. ire1∆ souches exprimant les ARNm indiqués représentés dans (UNE) soit dans un DUH1 ou duh1∆ de fond ont été analysés comme sur la figure 5C, sauf qu'un anticorps de haute sensibilité a été utilisé pour détecter 3xHA-Hac1 u p.

    Remarquablement, même un seul changement de nucléotide au centre de la région d'appariement des bases (Sathe et al., 2015) était suffisant pour une certaine accumulation de Hac1 up, qui encore a été renforcée par la suppression de DUH1 (Figure 6D). Ce résultat suggère que l'interaction d'appariement de bases 5'-UTR-intron n'est que marginalement stable, ce qui peut être nécessaire pour une dissociation efficace de l'intron après l'épissage (voir Discussion).

    Conséquences fonctionnelles d'un silence incomplet

    Collectivement, nous avons montré qu'une paire de mécanismes de silence, l'un traductionnel et l'autre post-traductionnel, empêche la production parasite de Hac1 up en l'absence de l'UPR. L'existence d'un tel mécanisme de silence à sécurité intégrée implique que la production ectopique de Hac1 up a des conséquences physiologiques qui ont un impact négatif sur l'aptitude cellulaire. Cependant, une étude précédente a suggéré que Hac1 up n'est pas en soi un facteur de transcription actif car il manque la queue activatrice de 18 acides aminés trouvée dans Hac1 ip (Mori et al., 2000), soulevant la question de savoir pourquoi l'accumulation de Hac1 up serait doivent être strictement réglementés. Nous avons émis l'hypothèse que Hac1 up était en fait un facteur de transcription actif, mais que dans l'étude précédente, son accumulation avait été empêchée grâce aux expériences réalisées dans un DUH1 Contexte. Pour tester cette hypothèse, nous avons évalué la capacité de souches qui produisent constitutivement soit Hac1 i p, Hac1 up ou Hac1 Δtail p à croître dans des conditions de stress chronique du RE induit par le médicament tunicamycine. Les souches exprimant Hac1 i p ou Hac1 Δtail p se sont développées sur un milieu contenant de la tunicamycine, que DUH1 (ou IRE1) était présent (figure 7A), cohérent avec le fait que les deux protéines sont des facteurs de transcription actifs qui ne sont pas ciblés par Duhlp. En revanche, les souches exprimant Hac1 u p ne se sont développées de manière robuste que sur un milieu contenant de la tunicamycine lorsque DUH1 a été assommé (mais indépendamment de IRE1). Ces résultats confirment notre hypothèse selon laquelle la dégradation dépendante de Duh1p masque normalement l'activité de Hac1 u p. Nos résultats expliquent également comment HAC1 a pu être initialement identifié comme un activateur à copie élevée de l'UPR dans un Feu1 souche, puisque l'activité UPR détectée dans cette souche devait provenir de Hac1 up produit à partir de HAC1 ARNm (Chapman et Walter, 1997 Cox et Walter, 1996).

    Exigence pour DUH1 pour supprimer l'activation indépendante d'Ire1p de l'UPR.

    (UNE) Analyse de l'activité Hac1p dans l'UPR. Souches exprimant la valeur indiquée HAC1 Variantes d'ARNm, avec (+) ou sans () IRE1 et/ou DUH1 présents, ont été cultivés jusqu'à saturation. Des séries de dilutions de 10 fois ont été étalées sur YPD sans (-Tm) ou avec (+Tm) 400 ng/ml de tunicamycine pour induire un stress du RE. (B) Impact de DUH1 sur détection de Hac1 u p. Souches exprimant les ARNm indiqués, avec (+) ou sans () IRE1 et/ou DUH1 présents, ont été analysés comme sur la figure 6C. La flèche noire indique la position de Hac1 u p, qui migre plus lentement que Hac1 i p. La construction 1, qui manque d'une étiquette 3xHA, a été utilisée comme contrôle négatif pour l'immunotransfert anti-HA. (C) Effet de la dégradation dépendante de Duh1p sur l'UPR. Souches exprimant le type sauvage HAC1 avec un tag 3xHA N-terminal, avec (+) ou sans () IRE1 et/ou DUH1 présents, ont été cultivés jusqu'à saturation. Des séries de dilutions de 10 fois ont été étalées sur YPD sans tunimacyine (-Tm) ou contenant la concentration indiquée de tunicamycine (+Tm). Les plaques ont été imagées aux jours 2 (en haut), 3 (au milieu) et 6 (en bas).

    Étant donné que Hac1 up a une activité induisant l'UPR (figure 7A), nous avons estimé que le mécanisme de sécurité que nous avons découvert est nécessaire pour empêcher la production de fuites de Hac1 up qui provoquerait autrement une activation indépendante d'Ire1p de l'UPR. Cependant, nous n'avons initialement pas réussi à détecter Hac1 up produit à partir de HAC1 ARNm même lorsque DUH1 a été perturbé (figure 5C). D'autre part, nos résultats de l'analogue GFP et HIS3 des études sur le gène rapporteur ont démontré que la répression traductionnelle médiée par l'appariement de bases 5'-UTR-intron était incomplète et permettait un faible niveau de synthèse protéique qui était normalement «nettoyé» par la dégradation dépendante de Duhlp (Figure 4D et E). Cela nous a conduit à émettre l'hypothèse que Hac1 u p lui-même était également parfois produit à partir de HAC1 ou ARNm et rapidement dégradé d'une manière dépendante de Duh1p, mais que la courte demi-vie de Hac1 up (Figure 5E) - par rapport à la fois à la GFP (Natarajan et al., 1998) et à His3p (Belle et al., 2006) - a encore été réduite l'abondance à l'état d'équilibre de Hac1 jusqu'à un niveau extrêmement bas qui était initialement indétectable.

    Pour améliorer la détection de Hac1 u p marqué par HA, nous avons apporté deux modifications : nous avons utilisé un anticorps anti-HA plus sensible pour l'immunotransfert et nous avons éliminé IRE1 dans nos souches, ce qui élimine l'épissage de fond dépendant d'Ire1p de HAC1 ARNm (figure 1 - supplément de la figure 1B) et production concomitante de Hac1 i p qui peut autrement dominer le signal sur les immunoblots. Avec ces modifications, nous pouvions maintenant détecter Hac1 up étant produit à partir de HAC1 ARNm, mais seulement lorsque la protéine a été stabilisée par délétion de DUH1 (Figure 7B) et à des niveaux bien inférieurs même à ceux de Hac1 up étant constitutivement produit en présence de DUH1 (Figure 7—supplément de la figure 1). Malgré le niveau relativement faible de produit de traduction fuyant que nous avons détecté, ces résultats fournissent des preuves moléculaires que Hac1 up est continuellement produit à partir de HAC1 ou ARNm mais rapidement dégradé en raison de son degron C-terminal.

    La production de fuites de Hac1 up est-elle démasquée par la suppression de DUH1 avoir des conséquences fonctionnelles ? La capacité de Hac1 up produit de manière constitutive à favoriser la survie dans des conditions induisant l'UPR (figure 7A) a suggéré que de petites quantités de Hac1 up p pourraient également induire l'UPR dans une certaine mesure. Pour tester cette possibilité, nous avons examiné comment les souches exprimant le HA marqué mais autrement non modifiées HAC1 L'ARNm s'est développé sur des milieux contenant différentes concentrations de tunicamycine. A la concentration la plus élevée de tunicamycine, seules les souches exprimant IRE1 pourrait croître indépendamment du fait que DUH1 était également présent (Figure 7C), suggérant que la croissance dépendait de l'abondante Hac1 i p produite à partir de HAC1 j'ARNm. En revanche, à des concentrations plus faibles de tunicamycine, la IRE1 souche de délétion a montré une certaine croissance, mais cela a été amélioré de manière reproductible par la délétion simultanée de DUH1. Ces résultats indiquent que le faible niveau de Hac1 u p détectable dans les souches dépourvues DUH1 (Figure 7B) est suffisant pour activer suffisamment l'UPR pour faciliter la survie des cellules sous stress, même en l'absence d'Ire1p. Ainsi, la dégradation degron-dépendante de Hac1 up médiée par Duh1p est normalement requise pour empêcher l'activation ectopique de l'UPR indépendante d'Ire1p.


    Mécanismes des médicaments antibactériens

    Objectif d'apprentissage

    Décrire les mécanismes d'action associés aux médicaments qui inhibent la biosynthèse de la paroi cellulaire, la synthèse des protéines, la fonction membranaire, la synthèse des acides nucléiques et les voies métaboliques

    Une qualité importante pour un médicament antimicrobien est toxicité sélective , ce qui signifie qu'il tue ou inhibe sélectivement la croissance des cibles microbiennes tout en causant peu ou pas de dommages à l'hôte. La plupart des médicaments antimicrobiens actuellement utilisés en clinique sont antibactériens car la cellule procaryote fournit une plus grande variété de cibles uniques pour la toxicité sélective, par rapport aux champignons, aux parasites et aux virus. Chaque classe de médicaments antibactériens a un mode d'action (la manière dont un médicament affecte les microbes au niveau cellulaire), et ceux-ci sont résumés dans Graphique 14.9 et Tableau 14.1 .

    Vaz, L.E. et al. « Prévalence des idées fausses des parents sur l'utilisation d'antibiotiques ». Pédiatrie 136 n°2 (août 2015). DOI : 10.1542/ peds.2015-0883.

    Graphique 14.9 Il existe plusieurs classes de composés antibactériens qui sont généralement classés en fonction de leur cible bactérienne.

    Médicaments antibactériens courants par mode d'action

    Inhibiteurs de la biosynthèse de la paroi cellulaire

    Plusieurs classes différentes d'antibactériens bloquent les étapes de la biosynthèse du peptidoglycane, rendant les cellules plus sensibles à la lyse osmotique ( Tableau 14.2 ). Par conséquent, les antibactériens qui ciblent la biosynthèse de la paroi cellulaire sont bactéricides dans leur action. Parce que les cellules humaines ne fabriquent pas de peptidoglycane, ce mode d'action est un excellent exemple de toxicité sélective.

    La pénicilline, le premier antibiotique découvert, est l'un des nombreux antibactériens d'une classe appelée -lactames . Ce groupe de composés comprend les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes, et se caractérise par la présence d'un cycle β-lactame trouvé dans la structure centrale de la molécule de médicament ( Graphique 14.10 ). Les antibactériens β-lactame bloquent la réticulation des chaînes peptidiques lors de la biosynthèse de nouveaux peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. Ils sont capables de bloquer ce processus car la structure des β-lactames est similaire à la structure du composant sous-unité peptidoglycane reconnu par l'enzyme transpeptidase de réticulation, également connue sous le nom de protéine de liaison à la pénicilline (PBP). Bien que le cycle β-lactame doive rester inchangé pour que ces médicaments conservent leur activité antibactérienne, des modifications chimiques stratégiques des groupes R ont permis le développement d'une grande variété de médicaments β-lactamines semi-synthétiques avec une puissance accrue, un spectre d'activité élargi et une durée de vie plus longue. demi-vies pour un meilleur dosage, entre autres caractéristiques.

    La pénicilline G et la pénicilline V sont des antibiotiques naturels des champignons et sont principalement actives contre les agents pathogènes bactériens gram-positifs, et quelques agents pathogènes bactériens gram-négatifs tels que Pasteurella multocida . Graphique 14.10 résume le développement semi-synthétique de certaines des pénicillines. Ajout d'un groupe amino (-NH 2 ) à la pénicilline G a créé les aminopénicillines (c'est-à-dire l'ampicilline et l'amoxicilline) qui ont un spectre d'activité accru contre davantage d'agents pathogènes à Gram négatif. De plus, l'ajout d'un groupe hydroxyle (-OH) à l'amoxicilline a augmenté la stabilité acide, ce qui permet une meilleure absorption orale. La méthicilline est une pénicilline semi-synthétique qui a été développée pour lutter contre la propagation des enzymes (pénicillinases) qui inactivaient les autres pénicillines. Le remplacement du groupe R de la pénicilline G par le groupe diméthoxyphényle plus volumineux a permis de protéger le cycle β-lactame de la destruction enzymatique par les pénicillinases, nous donnant ainsi la première pénicilline résistante à la pénicillinase.

    Semblable aux pénicillines, céphalosporines contiennent un cycle β-lactame ( Graphique 14.10 ) et bloquent l'activité transpeptidase des protéines de liaison à la pénicilline. Cependant, l'anneau β-lactame des céphalosporines est fusionné à un anneau à six membres, plutôt qu'à l'anneau à cinq membres trouvé dans les pénicillines. Cette différence chimique confère aux céphalosporines une résistance accrue à l'inactivation enzymatique par -lactamases . Le médicament céphalosporine C a été isolé à l'origine du champignon Cephalosporium acremonium dans les années 1950 et a un spectre d'activité similaire à celui de la pénicilline contre les bactéries gram-positives, mais est actif contre plus de bactéries gram-négatives que la pénicilline. Une autre différence structurelle importante est que la céphalosporine C possède deux groupes R, contre un seul groupe R pour la pénicilline, ce qui permet une plus grande diversité dans les altérations chimiques et le développement des céphalosporines semi-synthétiques. La famille des céphalosporines semi-synthétiques est beaucoup plus vaste que les pénicillines, et ces médicaments ont été classés en générations en fonction principalement de leur spectre d'activité, allant des céphalosporines à spectre étroit de première génération aux céphalosporines à large spectre de quatrième génération. céphalosporines. Une nouvelle céphalosporine de cinquième génération a été développée, active contre les résistances à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM).

    Les carbapénèmes et les monobactames ont également un cycle β-lactame dans le cadre de leur structure centrale, et ils inhibent l'activité transpeptidase des protéines de liaison à la pénicilline. Le seul monobactam utilisé en clinique est l'aztréonam. C'est un antibactérien à spectre étroit avec une activité uniquement contre les bactéries gram-négatives. En revanche, la famille des carbapénèmes comprend une variété de médicaments semi-synthétiques (imipénème, méropénème et doripénème) qui offrent une activité à très large spectre contre les agents pathogènes bactériens à Gram positif et à Gram négatif.

    La drogue vancomycine , un membre d'une classe de composés appelés les glycopeptides , a été découvert dans les années 1950 comme antibiotique naturel de l'actinomycète Amycolatopsis orientalis . Semblable aux -lactames, la vancomycine inhibe la biosynthèse de la paroi cellulaire et est bactéricide. Cependant, contrairement aux -lactames, la structure de la vancomycine n'est pas similaire à celle des sous-unités de peptidoglycane de la paroi cellulaire et n'inactive pas directement les protéines de liaison à la pénicilline. Au contraire, la vancomycine est une très grosse molécule complexe qui se lie à l'extrémité de la chaîne peptidique des précurseurs de la paroi cellulaire, créant un blocage structurel qui empêche les sous-unités de la paroi cellulaire d'être incorporées dans la N-acétylglucosamine et l'acide N-acétylmuramique en croissance (NAM -NAG) squelette de la structure du peptidoglycane (transglycosylation). La vancomycine bloque également structurellement la transpeptidation. La vancomycine est bactéricide contre gram-

    pathogènes bactériens positifs, mais il n'est pas actif contre les bactéries gram-négatives en raison de son incapacité à pénétrer la membrane externe protectrice.

    La drogue bacitracine consiste en un groupe d'antibiotiques peptidiques de structure similaire, isolés à l'origine de Bacillus subtilis . La bacitracine bloque l'activité d'une molécule spécifique de la membrane cellulaire qui est responsable du mouvement des précurseurs du peptidoglycane du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule, empêchant finalement leur incorporation dans la paroi cellulaire. La bacitracine est efficace contre un large éventail de bactéries, y compris les organismes à Gram positif trouvés sur la peau, tels que Staphylocoque et Streptocoque . Bien qu'elle puisse être administrée par voie orale ou intramusculaire dans certaines circonstances, la bacitracine s'est révélée néphrotoxique (endommageant les reins). Par conséquent, il est plus souvent associé à la néomycine et à la polymyxine dans des onguents topiques tels que Neosporin.

    Graphique 14.10 Les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes contiennent tous un cycle β-lactame, le site d'attaque en inactivant les enzymes β-lactamases. Bien qu'elles partagent toutes le même noyau, diverses pénicillines diffèrent les unes des autres par la structure de leurs groupes R. Les modifications chimiques des groupes R ont fourni un spectre d'activité, une stabilité acide et une résistance à la dégradation de la β-lactamase accrus.

    Médicaments qui inhibent la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne

    Mécanisme d'action

    Naturel ou semi-synthétique

    Spectre d'activité

    Spectre étroit contre les bactéries gram-positives et quelques bactéries gram-négatives

    Médicaments qui inhibent la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne

    Mécanisme d'action

    Naturel ou semi-synthétique

    Spectre d'activité

    Spectre étroit contre les bactéries gram-positives mais avec un spectre gram-négatif accru

    Spectre étroit contre les bactéries gram-positives uniquement, y compris les souches produisant de la pénicillinase

    Spectre étroit similaire à la pénicilline mais avec un spectre gram-négatif accru

    Céphalosporines de première génération

    Spectre étroit similaire à la céphalosporine C

    Céphalosporines de deuxième génération

    Spectre étroit mais avec un spectre gram-négatif accru par rapport à la première génération

    Céphalosporines de troisième et quatrième générations

    Large spectre contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, y compris certains producteurs de β-lactamases

    Céphalosporines de cinquième génération

    Large spectre contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, y compris le SARM

    Spectre étroit contre les bactéries gram-négatives, y compris certains producteurs de β-lactamases

    Spectre le plus large des -lactames contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, y compris de nombreux producteurs de β-lactamases

    Spectre étroit contre les bactéries gram-positives uniquement, y compris les souches multirésistantes

    Médicaments qui inhibent la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne

    Mécanisme d'action

    Naturel ou semi-synthétique

    Spectre d'activité

    Décrire le mode d'action des -lactames.

    Inhibiteurs de la biosynthèse des protéines

    Les ribosomes cytoplasmiques trouvés dans les cellules animales (80S) sont structurellement distincts de ceux trouvés dans les cellules bactériennes (70S), faisant de la biosynthèse des protéines une bonne cible sélective pour les médicaments antibactériens. Plusieurs types d'inhibiteurs de la biosynthèse des protéines sont abordés dans cette section et sont résumés dans 14.11 .

    Inhibiteurs de la synthèse des protéines qui se lient à la sous-unité 30S

    Les aminosides sont de gros médicaments antibactériens hautement polaires qui se lient à la sous-unité 30S des ribosomes bactériens, ce qui nuit à la capacité de relecture du complexe ribosomique. Cette déficience provoque des discordances entre les codons et les anticodons, entraînant la production de protéines avec des acides aminés incorrects et des protéines raccourcies qui s'insèrent dans la membrane cytoplasmique. La rupture de la membrane cytoplasmique par les protéines défectueuses tue les cellules bactériennes. Les aminosides , qui comprennent des médicaments tels que la streptomycine, la gentamicine, la néomycine et la kanamycine, sont de puissants antibactériens à large spectre. Cependant, il a été démontré que les aminosides sont néphrotoxiques (endommageant les reins), neurotoxiques (endommageant le système nerveux) et ototoxiques (endommageant l'oreille).

    Une autre classe de composés antibactériens qui se lient à la sous-unité 30S est le tétracyclines . Contrairement aux aminosides, ces médicaments sont bactériostatiques et inhibent la synthèse des protéines en bloquant l'association des ARNt avec le ribosome lors de la traduction. Les tétracyclines naturelles produites par diverses souches de Streptomyces ont été découvertes pour la première fois dans les années 1940, et plusieurs tétracyclines semi-synthétiques, dont la doxycycline et la tigécycline, ont également été produites. Bien que les tétracyclines couvrent un large spectre d'agents pathogènes bactériens, les effets secondaires qui peuvent limiter leur utilisation incluent la phototoxicité, la décoloration permanente des dents en développement et la toxicité hépatique à fortes doses ou chez les patients atteints d'insuffisance rénale.

    Inhibiteurs de la synthèse des protéines qui se lient à la sous-unité 50S

    Il existe plusieurs classes de médicaments antibactériens qui agissent en se liant à la sous-unité 50S des ribosomes bactériens. Les médicaments antibactériens macrolides ont une structure cyclique large et complexe et font partie d'une classe plus large de métabolites secondaires produits naturellement appelés polycétides, composés complexes produits de manière progressive par l'ajout répété d'unités à deux carbones par un mécanisme similaire à celui utilisé pour synthèse des acides gras. Les macrolides sont des médicaments bactériostatiques à large spectre qui bloquent l'allongement des protéines en inhibant la formation de liaisons peptidiques entre des combinaisons spécifiques d'acides aminés. Le premier macrolide a été érythromycine . Il a été isolé en 1952 de Streptomyces erythreus et empêche la translocation. Les macrolides semi-synthétiques comprennent l'azithromycine et la télithromycine. Par rapport à l'érythromycine, azithromycine a un spectre d'activité plus large, moins d'effets secondaires et une demi-vie significativement plus longue (1,5 heures pour l'érythromycine contre 68 heures pour l'azithromycine) qui permet une administration une fois par jour et un traitement court de 3 jours (c'est-à-dire la formulation Zpac ) pour la plupart des infections. La télithromycine est le premier semi-synthétique

    dans la classe connue sous le nom de cétolides. Bien que la télithromycine montre une puissance et une activité accrues contre les agents pathogènes résistants aux macrolides, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a limité son utilisation au traitement de la pneumonie communautaire et exige la plus forte étiquette « d'avertissement de boîte noire » pour le médicament en raison de son hépatotoxicité grave. .

    Les lincosamides inclure le produit naturellement lincomycine et semi-synthétique clindamycine . Bien que structurellement distincts des macrolides, les lincosamides sont similaires dans leur mode d'action aux macrolides en se liant à la sous-unité ribosomique 50S et en empêchant la formation de liaisons peptidiques. Les lincosamides sont particulièrement actifs contre les infections streptococciques et staphylococciques.

    La drogue chloramphénicol représente encore une autre classe structurellement distincte d'antibactériens qui se lient également au ribosome 50S, inhibant la formation de liaisons peptidiques. Chloramphénicol, produit par Streptomyces venezuelae , a été découvert en 1947 en 1949, il est devenu le premier antibiotique à large spectre approuvé par la FDA. Bien qu'il s'agisse d'un antibiotique naturel, il est également facilement synthétisé et a été le premier médicament antibactérien produit synthétiquement en masse. En raison de sa production de masse, de sa couverture à large spectre et de sa capacité à pénétrer efficacement dans les tissus, le chloramphénicol a été historiquement utilisé pour traiter un large éventail d'infections, de la méningite à la fièvre typhoïde en passant par la conjonctivite. Malheureusement, des effets secondaires graves, tels que le syndrome du bébé gris mortel et la suppression de la production de moelle osseuse, ont limité son rôle clinique. Le chloramphénicol provoque également l'anémie de deux manières différentes. Un mécanisme implique le ciblage des ribosomes mitochondriaux dans les cellules souches hématopoïétiques, provoquant une suppression réversible et dose-dépendante de la production de cellules sanguines. Une fois le dosage du chloramphénicol arrêté, la production de cellules sanguines revient à la normale. Ce mécanisme met en évidence la similitude entre les ribosomes 70S des bactéries et les ribosomes 70S au sein de nos mitochondries. Le deuxième mécanisme de l'anémie est idiosyncratique (c'est-à-dire que le mécanisme n'est pas compris) et implique une perte létale irréversible de la production de cellules sanguines connue sous le nom d'anémie aplasique. Ce mécanisme d'anémie aplasique n'est pas dose-dépendant et peut se développer après l'arrêt du traitement. En raison de problèmes de toxicité, l'utilisation du chloramphénicol chez l'homme est maintenant rare aux États-Unis et se limite aux infections graves ne pouvant être traitées par des antibiotiques moins toxiques. Parce que ses effets secondaires sont beaucoup moins graves chez les animaux, il est utilisé en médecine vétérinaire.

    Les oxazolidinones , y compris le linézolide, sont une nouvelle classe à large spectre d'inhibiteurs de synthèse de protéines synthétiques qui se lient à la sous-unité ribosomique 50S des bactéries gram-positives et gram-négatives. Cependant, leur mécanisme d'action semble quelque peu différent de celui des autres inhibiteurs de la synthèse des protéines liant les sous-unités 50S déjà discutés. Au lieu de cela, ils semblent interférer avec la formation du complexe d'initiation (association de la sous-unité 50S, de la sous-unité 30S et d'autres facteurs) pour la traduction, et ils empêchent la translocation de la protéine en croissance du site ribosomique A au site P. Tableau 14.3 résume les inhibiteurs de la synthèse des protéines.

    14.11 Les principales classes d'inhibiteurs de la synthèse des protéines ciblent les sous-unités 30S ou 50S des ribosomes cytoplasmiques.

    Médicaments qui inhibent la synthèse des protéines bactériennes

    Mécanisme d'action

    Bactériostatique ou bactéricide

    Spectre d'activité

    Provoque des discordances entre les codons et les anticodons, conduisant à des protéines défectueuses qui s'insèrent dans et perturbent la membrane cytoplasmique Aminoglycosides Streptomycine, gentamicine, néomycine, kanamycine Bloque la formation de liaisons peptidiques entre les acides aminés Macrolides Érythromycine, azithromycine, télithromycine

    Comparez et contrastez les différents types d'inhibiteurs de la synthèse des protéines.

    Inhibiteurs de la fonction membranaire

    Un petit groupe d'antibactériens cible la membrane bactérienne comme mode d'action ( Tableau 14.4 ). Les polymyxines sont des antibiotiques polypeptidiques naturels qui ont été découverts pour la première fois en 1947 en tant que produits de Bacillus polymyxa uniquement la polymyxine B et la polymyxine E ( colistine ) ont été utilisés en clinique. Ils sont lipophiles avec des propriétés de type détergent et interagissent avec le composant lipopolysaccharide de la membrane externe des bactéries gram-négatives, perturbant finalement leurs membranes externe et interne et tuant les cellules bactériennes. Malheureusement, le mécanisme de ciblage membranaire n'est pas une toxicité sélective, et ces médicaments ciblent et endommagent également la membrane des cellules du rein et du système nerveux lorsqu'ils sont administrés par voie systémique. En raison de ces effets secondaires graves et de leur faible absorption par le tube digestif, la polymyxine B est utilisée dans les onguents antibiotiques topiques en vente libre (par exemple, Neosporin), et la colistine orale était historiquement utilisée uniquement pour la décontamination intestinale afin de prévenir les infections provenant de l'intestin. microbes chez les patients immunodéprimés ou pour ceux qui subissent certaines chirurgies abdominales. Cependant, l'émergence et la propagation d'agents pathogènes multirésistants ont conduit à une utilisation accrue de la colistine intraveineuse dans les hôpitaux, souvent comme médicament de dernier recours pour traiter les infections graves. L'antibactérien daptomycine est un lipopeptide cyclique produit par Streptomyces roseosporus qui semble fonctionner comme les polymyxines, s'insérant dans la membrane cellulaire bactérienne et la perturbant. Cependant, contrairement à la polymyxine B et à la colistine, qui ciblent uniquement les bactéries gram-négatives, la daptomycine cible spécifiquement les bactéries gram-positives. Il est généralement administré par voie intraveineuse et semble bien toléré, montrant une toxicité réversible dans les muscles squelettiques.

    Médicaments qui inhibent la fonction membranaire bactérienne

    Mécanisme d'action

    Spectre d'activité

    Dosage intraveineux pour traiter les cas systémiques graves

    Médicaments qui inhibent la fonction membranaire bactérienne

    Mécanisme d'action

    Spectre d'activité

    Comment les polymyxines inhibent-elles la fonction membranaire ?

    Inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques

    Certains médicaments antibactériens agissent en inhibant la synthèse des acides nucléiques ( Tableau 14.5 ). Par exemple, métronidazole est un membre semi-synthétique de la famille des nitroimidazoles qui est également un antiprotozoaire. Il interfère avec la réplication de l'ADN dans les cellules cibles. La drogue rifampicine est un membre semi-synthétique de la famille de la rifamycine et fonctionne en bloquant l'activité de l'ARN polymérase dans les bactéries. Les enzymes ARN polymérase des bactéries sont structurellement différentes de celles des eucaryotes, assurant une toxicité sélective contre les cellules bactériennes. Il est utilisé pour le traitement d'une variété d'infections, mais son utilisation principale, souvent en cocktail avec d'autres médicaments antibactériens, est contre les mycobactéries qui causent la tuberculose. Malgré la sélectivité de son mécanisme, la rifampine peut inciter les enzymes hépatiques à augmenter le métabolisme d'autres médicaments administrés (antagonisme), entraînant une hépatotoxicité (toxicité hépatique) et influençant négativement la biodisponibilité et l'effet thérapeutique des médicaments compagnons.

    Un membre de la famille des quinolones, un groupe d'antimicrobiens synthétiques, est acide nalidixique . Il a été découvert en 1962 comme sous-produit lors de la synthèse de la chloroquine, un médicament antipaludique. L'acide nalidixique inhibe sélectivement l'activité de l'ADN gyrase bactérienne, bloquant la réplication de l'ADN. Les modifications chimiques apportées au squelette original de la quinolone ont abouti à la production de fluoroquinolones , comme la ciprofloxacine et la lévofloxacine, qui inhibent également l'activité de l'ADN gyrase. La ciprofloxacine et la lévofloxacine sont efficaces contre un large spectre de bactéries gram-positives ou gram-négatives et font partie des antibiotiques les plus couramment prescrits pour traiter un large éventail d'infections, notamment les infections des voies urinaires, les infections respiratoires, les infections abdominales et les infections cutanées. . Cependant, malgré leur toxicité sélective contre l'ADN gyrase, les effets secondaires associés aux différentes fluoroquinolones incluent la phototoxicité, la neurotoxicité, la cardiotoxicité, le dysfonctionnement du métabolisme du glucose et un risque accru de rupture du tendon.

    Médicaments qui inhibent la synthèse des acides nucléiques bactériens

    Mécanismes d'action

    Spectre d'activité

    Spectre étroit avec activité

    contre Gram positif et limité

    nombre de bactéries gram-négatives.

    bactéries positives et gram-négatives

    Pourquoi les inhibiteurs de la synthèse bactérienne des acides nucléiques ne ciblent-ils pas les cellules hôtes ?

    Inhibiteurs des voies métaboliques

    Certaines drogues synthétiques contrôlent les infections bactériennes en agissant comme antimétabolites , inhibiteurs compétitifs des enzymes métaboliques bactériennes ( Tableau 14.6 ). Les sulfamides ( sulfamides ) sont les agents antibactériens synthétiques les plus anciens et sont des analogues structuraux de para -acide aminobenzoïque (PABA), un intermédiaire précoce dans la synthèse de l'acide folique ( Graphique 14.12 ). En inhibant l'enzyme impliquée dans la production d'acide dihydrofolique, les sulfamides bloquent la biosynthèse bactérienne de l'acide folique et, par la suite, des pyrimidines et des purines nécessaires à la synthèse des acides nucléiques. Ce mécanisme d'action fournit une inhibition bactériostatique de la croissance contre un large spectre d'agents pathogènes à Gram positif et à Gram négatif. Parce que les humains obtiennent l'acide folique de la nourriture au lieu de le synthétiser intracellulairement, les sulfamides sont sélectivement toxiques pour les bactéries. Cependant, les réactions allergiques aux sulfamides sont courantes. Les sulfones sont structurellement similaires aux sulfamides mais ne sont pas couramment utilisés aujourd'hui, sauf pour le traitement de la maladie de Hansen (lèpre).

    Le triméthoprime est un composé antimicrobien synthétique qui sert d'antimétabolite dans la même voie de synthèse de l'acide folique que les sulfamides. Cependant, triméthoprime est un analogue structurel de l'acide dihydrofolique et inhibe une étape ultérieure de la voie métabolique ( Graphique 14.12 ). Le triméthoprime est utilisé en association avec le sulfaméthoxazole pour traiter les infections des voies urinaires, les otites et la bronchite. Comme discuté, la combinaison de triméthoprime et de sulfaméthoxazole est un exemple de synergie antibactérienne. Lorsqu'il est utilisé seul, chaque antimétabolite ne fait que diminuer la production d'acide folique à un niveau où l'inhibition bactériostatique de la croissance se produit. Cependant, lorsqu'elles sont utilisées en combinaison, l'inhibition des deux étapes de la voie métabolique diminue la synthèse d'acide folique à un niveau mortel pour la cellule bactérienne. En raison de l'importance de l'acide folique pendant le développement du fœtus, l'utilisation de sulfamides et de triméthoprime doit être soigneusement envisagée au début de la grossesse.

    La drogue isoniazide est un antimétabolite ayant une toxicité spécifique pour les mycobactéries et a longtemps été utilisé en association avec la rifampicine ou la streptomycine dans le traitement de la tuberculose. Il est administré en tant que promédicament, nécessitant une activation par l'action d'une enzyme peroxydase bactérienne intracellulaire, formant l'isoniazide-nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et l'isoniazide-nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), empêchant finalement la synthèse de l'acide mycolique, qui est essentiel pour les parois cellulaires mycobactériennes. Les effets secondaires possibles de l'utilisation de l'isoniazide comprennent l'hépatotoxicité, la neurotoxicité et la toxicité hématologique (anémie).

    Graphique 14.12 Les sulfamides et le triméthoprime sont des exemples d'antimétabolites qui interfèrent dans la synthèse bactérienne de l'acide folique en bloquant la biosynthèse des purines et des pyrimidines, inhibant ainsi la croissance bactérienne.

    Médicaments antimétabolites

    Cible de la voie métabolique

    Mécanisme d'action

    Spectre d'activité

    Large spectre contre les bactéries gram-positives et gram-négatives

    Large spectre contre les bactéries gram-positives et gram-négatives

    Médicaments antimétabolites

    Cible de la voie métabolique

    Mécanisme d'action

    Spectre d'activité

    Spectre étroit contre Mycobactérie spp., y compris M. tuberculose

    Comment les sulfamides et le triméthoprime ciblent-ils sélectivement les bactéries ?

    Inhibiteur de l'ATP synthase

    La bédaquiline, qui représente la classe de composés antibactériens synthétiques appelés diarylquinolones, utilise un nouveau mode d'action qui inhibe spécifiquement la croissance mycobactérienne. Bien que le mécanisme spécifique n'ait pas encore été élucidé, ce composé semble interférer avec la fonction des ATP synthases, peut-être en interférant avec l'utilisation du gradient d'ions hydrogène pour la synthèse d'ATP par phosphorylation oxydative, conduisant à une production réduite d'ATP. En raison de ses effets secondaires, y compris l'hépatotoxicité et l'arythmie cardiaque potentiellement mortelle, son utilisation est réservée aux cas de tuberculose graves, autrement incurables.


    REMARQUES FINALES

    EF-P a d'abord été découvert comme un facteur d'élongation qui a favorisé la formation de liaisons peptidiques entre les accepteurs d'aminoacyle médiocres. Pendant un certain temps, on a mal compris que EF-P était impliqué dans la synthèse de la première liaison peptidique, mais maintenant nous le reconnaissons comme un facteur d'élongation de bonne foi, bien que très inhabituel en ce qu'il présente une spécificité de séquence. Les approches de génétique moléculaire et au niveau des systèmes montrent que l'exigence de spécificité dépend de l'amélioration du taux de traduction grâce à des séquences primaires codant pour des substrats de transfert de peptidyle particulièrement pauvres comme les prolines consécutives. Ainsi, après près de 4 décennies d'études, notre compréhension de l'activité d'EF-P est bouclée et le rôle d'EF-P dans la traduction proposé par Glick, Chládek et Ganoza en 1979 semble exact.

    Bien que nous en comprenions beaucoup plus sur EF-P aujourd'hui que lorsqu'il a été découvert, de nombreux aspects de la biologie de l'EF-P restent mystérieux. Par exemple, EF-P favorise la traduction à travers de nombreux motifs XPPX, mais pas tous, faisant allusion à d'autres règles qui régissent sa spécificité. De plus, toutes les protéines qui subissent un blocage induit par XPPX ne présentent pas réellement un nombre de copies de protéines réduit (Elgamal et al. 2014 Woolstenhulme et al. 2015). La raison exacte pour laquelle certains motifs XPPX sont particulièrement difficiles à traduire n'est pas tout à fait claire, pas plus que le mécanisme par lequel EF-P résout ce problème. La fonction de modification post-traductionnelle, autrefois considérée comme essentielle pour l'activité EF-P, mérite d'être reconsidérée car EF-P non modifié et des variantes modifiées avec une fraction chimique étrangère ont été récemment signalées comme fonctionnelles (Hummels et al. 2017 Volkwein et al. 2019). Si la modification fait partie du mécanisme par lequel EF-P soulage la pause traductionnelle, comment autant de modifications diverses peuvent-elles toutes s'adapter à une fonction conservée ? Alternativement, si la modification est réglementaire, quand et comment la modification est-elle ajoutée ou modifiée pour changer la fonction EF-P ?

    Enfin, et peut-être la plus grande question, est la suivante : comment EF-P favorise-t-il la croissance ? L'absence d'EF-P entraîne des niveaux réduits d'un sous-ensemble de protéines dont certaines sont des enzymes impliquées dans le métabolisme essentiel. Cependant, les enzymes sont plutôt résistantes à la fluctuation de l'abondance, et il n'est pas clair pourquoi une réduction de leur(s) niveau(s) limiterait la croissance, voire inhiberait. De plus, des travaux récents suggèrent que l'exigence d'EF-P, au moins dans E. coli, peut être soulagée de manière conditionnelle simplement en induisant une croissance plus lente à des températures plus basses (Tollerson, Witzky et Ibba 2018). Si une croissance lente et la réduction correspondante de la vitesse de traduction sont suffisantes pour abolir le besoin d'EF-P, alors pourquoi EF-P semble-t-il essentiel dans les organismes à croissance lente tels que Mycobactérie (Sassetti, Boyd et Rubin 2003) ? Il est clair que EF-P est conservé à la fois dans sa forme et dans sa fonction dans tous les organismes dans tous les domaines de la vie et joue un rôle spécifique mais néanmoins important dans le maintien de taux de traduction élevés. L'essentialité de la croissance serait une sélection forte pour assurer une conservation aussi élevée, mais si EF-P n'est pas strictement requis pour la croissance, pourquoi est-il si hautement conservé ?



Commentaires:

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  3. Giselmaere

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